間充質干細胞治療克羅恩病肛瘺研究進展

程 芳綜述，張 浩審校（重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科，重慶400010）

克羅恩?。–D）是一種以透壁炎癥和瘺管形成特征的慢性炎癥性腸病，肛瘺是其常見并發癥。目前，肛瘺的治療包括藥物與外科手術，但均不能實現CD肛瘺的治愈。近年來，間充質干細胞（MSCs）對CD肛瘺的治療日益得到重視，由于其具有抗炎、免疫調節、組織修復等潛能，可實現腸道免疫的重建，從根本上避免免疫介導的腸道炎癥的發生，有可能實現CD肛瘺的長期愈合，提高患者生活質量，是治愈CD肛瘺最具潛力的新型治療方法。現將MSCs治療CD肛瘺的臨床研究進展綜述如下。

1 CD肛瘺的治療概述

CD是一類免疫介導的以消化道炎癥為主要表現的慢性復發性、全身性疾病，其特征在于透壁性。目前認為，其發病是遺傳易感宿主免疫系統對腸道微生態免疫失調所致，其中包括促炎性免疫細胞和細胞因子誘導腸道組織損傷，瘺管形成可涉及整個腸道。

肛瘺是CD最常見并發癥之一，高達26.0%～28.0%的患者在診斷CD后20年內會形成肛瘺，特別是結腸、直腸受累者。

肛瘺相關的疼痛、瘺管排泄、膿腫形成等嚴重降低了患者生活質量。目前，CD肛瘺的治療主要包括抗菌藥物、免疫抑制劑、生物制劑等藥物治療和外科手術治療，但60.0%～70.0%的患者藥物治療停止后會復發，僅少部分患者可實現長期緩解[1]。

以英夫利昔為例，盡管其治療CD肛瘺有效，但在英夫利昔終止治療3個月后，CD肛瘺復發率達50.0%，即使維持治療，在第54周也只有36.0%的患者維持瘺管的完全閉合[2]；且有研究顯示，英夫利昔治療時相當部分患者會再次遭受疾病活動與復發[3]，且生物制劑的長期使用可能增加患者機會性感染與發生惡性腫瘤的概率，因此，生物制劑維持瘺管的持續愈合作用是有限的，在風險與效益平衡之間仍然存在巨大挑戰。

外科手術是肛瘺治療的另一種選擇，但術后復發率也為11.0%～45.0%，另外10.0%～35.0%的患者在術后出現大便失禁。還有研究表明，糞菌移植具有控制CD病情活動度的作用，但復發率也較高，20.0%～40.0%的患者最終將進行直腸切除術[4]。因此，CD肛瘺的治療及實現長期愈合仍是臨床醫生面臨的重大挑戰。近年來，再生醫學及干細胞生物學領域取得巨大進步，干細胞治療已成為臨床研究熱點，多項臨床研究已證實，MSCs對目前藥物及外科手術治療失敗的CD肛瘺患者具有積極的治療作用，為CD肛瘺提供了一種具有前景的新型替代治療方法。

2 MSCs治療CD肛瘺的機制

干細胞是具有自我更新能力的未分化細胞，主要包括胚胎干細胞和成體干細胞，后者又可分成MSCs、造血干細胞和腸道干細胞等，當前用于CD肛瘺治療較多的MSCs是來源于中胚層的具有免疫抑制及促進組織修復的非造血多能干細胞，在不同微環境下可分化成脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等不同類型的間質細胞。MSCs可從骨髓、脂肪、臍帶、胎盤或大多數器官的結締組織中分離。MSCs表達低水平的人類白細胞抗原-Ⅰ類抗原（HLA-Ⅰ），而不表達人類白細胞抗原-Ⅱ類抗原（HLA-Ⅱ）和共刺激分子（如 CD80、CD86或 CD40），所以，免疫原性極低。

MSCs治療CD肛瘺的機制可能包括以下方面：（1）MSCs的免疫調節是依賴于炎癥環境的多級過程。①樹突狀細胞和巨噬細胞等抗原呈遞細胞通過T淋巴細胞的生成和極化參與了CD肛瘺的發病。MSCs通過抑制異基因淋巴細胞增殖而發揮免疫調節作用已經多項臨床研究證實[5-6]。在CD肛瘺患者中樹突狀細胞產生T淋巴細胞應答，調節性T淋巴細胞（Treg）比例是降低的，特別是在外周血中更低。MSCs可通過下調細胞周期蛋白D2和p27Kip1表達，導致細胞周期停滯于G0/G1期，從而抑制單核細胞向樹突狀細胞的成熟，抑制樹突狀細胞的抗原呈遞和遷移功能。且還可通過對樹突狀細胞成熟標志物，如主要組織相容性復合體Ⅱ、共刺激分子（CD40、CD80和CD86）的下調來抑制樹突狀細胞的遷移、成熟、抗原呈遞功能。MSCs通過Notch信號通路誘導單核細胞分化成調節性樹突狀細胞，同時，增加抗炎性細胞因子——白細胞介素-10（IL-10）等的分泌并減少促炎性細胞因子——IL-12等的生成，阻止初始和記憶CD4+細胞及CD8+T淋巴細胞的增殖、分化，促進初始及記憶T淋巴細胞生成Treg。②CD肛瘺的發病機制還涉及輔助性T淋巴細胞1（Th1）/Th17與Treg分化比例失衡，MSCs可抑制Th1、Th17分泌促炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α、γ 干擾素（IFN-γ）、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23等，促進具有抑制自身免疫和有免疫耐受作用的CD4+CD25+FoxP3+調節性T淋巴細胞的生成，同時，通過分泌可溶性因子，如前列腺素E2、轉化生長因子-β1、HLA-G等或依賴T淋巴細胞與CC類趨化因子配體1（CCL1）和CC類趨化因子受體8（CCR8）之間的相互作用，從初始及記憶T淋巴細胞中招募Treg，從而恢復Th1/Th17與Treg之間的平衡，發揮其免疫調節功能。當然MSCs還可依賴環境信號和MSCs/效應細胞比例，作用于B淋巴細胞和自然殺傷細胞，抑制B淋巴細胞活化、增殖、趨化和免疫球蛋白G的分泌，增加IL-10產生CD5+調節性B淋巴細胞，促進幼稚B淋巴細胞增殖、分化為可分泌免疫球蛋白的漿細胞，同時，抑制自然殺傷細胞增殖及其分泌促炎性細胞因子。在體內MSCs遷移到炎癥部位對基質細胞衍生因子-1α及次級淋巴組織趨化因子及在體外對補體蛋白、生長因子和趨化因子做出應答。在炎癥部位MSCs通過IFN-γ、腫瘤壞死因子-α或IL-1β的激活產生可溶性免疫應答抑制因子（包括吲哚胺2，3-雙加氧酶、前列腺素E2、腫瘤壞死因子-α刺激基因-6和一氧化氮）導致巨噬細胞極化到抗炎M2表型，誘導耐受性樹突狀細胞和Treg，促進Th1/Th2轉換，抑制肥大細胞和Th17分化，以及誘導T淋巴細胞凋亡。③MSCs還通過涉及細胞凋亡的膜表面分子/細胞凋亡的膜表面分子配體途徑、程序性死亡分子-1/程序性死亡配體-1、半乳凝素、CD39-腺苷代謝和Notch信號的接觸依賴性殺傷機制誘導T淋巴細胞凋亡，發揮其免疫調節作用。（2）MSCs促進損傷組織修復。MSCs可通過IFN-γ、IL-1β等的激活和血管細胞黏附分子抗體包被來促進其向腸道炎癥組織“歸巢”。MSCs還可通過表達生長因子，如血管內皮生長因子、血小板生長因子等及通過趨化因子與各種CC類趨化因子受體之間的相互作用作為調節遷移的信號，選擇性地遷移到腸道固有層、肌層、黏膜下層和腸系膜淋巴結等損傷及炎癥部位而發揮作用。且MSCs還可分泌參與炎性免疫細胞遷移的黏附分子（細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子等）和整聯蛋白，促進MSCs遷移至腸道炎癥組織。在腸道炎癥組織中MSCs能分化成不同類型的間質細胞，上調平滑肌肌動蛋白表達，促進受損組織修復。但也有研究表明，MSCs的組織修復能力并非由于其具有自身分化能力，而是MSCs通過刺激血管生成和抑制受損組織細胞的凋亡及纖維化來刺激局部損傷組織細胞的存活及恢復其功能。目前，尚不清楚MSCs在損傷組織中停留的時間長短，大多數研究對MSCs在腸道組織中的追蹤分析僅在注射后第1周，且每次均能在腸道炎癥區域被發現[7-8]。也有研究發現，在MSCs注射后第5天可在腸道炎癥區域被檢測到，而在第7天未能被追蹤到[9]。另有證據表明，MSCs在注射后存在于腸道炎癥組織中至少15 d[10]。

3 MSCs對CD肛瘺治療的臨床應用及安全性

目前，已有11項臨床研究證實，自體或同種異體來源的骨髓或脂肪MSCs局部瘺管內注射治療難治性CD肛瘺的療效佳及安全性可。累計有300多例CD肛瘺患者接受了MSCs局部瘺管內注射治療，其中大部分患者對藥物或外科手術治療失敗，研究結果顯示，超過50.0%的CD肛瘺可得到臨床應答，且該臨床應答在75.0%的患者中可持續至少 24周[11-21]。2005年，GARCíA-OLMO等[11]首次報道采用MSCs治療難治性CD肛瘺患者，結果顯示，75.0%的患者可在第8周實現瘺管閉合。2016年，發表于Lancet雜志的具有里程碑意義的Ⅲ期臨床研究納入了212例難治性CD肛瘺患者，107例患者被隨機分配到單次瘺管內注射120×106同種異體脂肪MSCs（Cx601組），105例患者被隨機分配至接受瘺管內注射24 mL生理鹽水作為對照組，結果顯示，至24周時Cx601組患者肛瘺聯合緩解率（臨床查體、磁共振成像檢查）高于對照組，分別為50.0%、34.0%，且Cx601組患者可在更短時間獲得肛瘺臨床緩解，分別為6.7、14.6周。目前該研究仍在進行中，計劃延長觀察到104周[20]。2015年進行的一項meta分析結果同樣顯示，MSCs治療CD肛瘺的療效佳，CD肛瘺患者愈合率可達61.3%，且僅出現了輕度不良事件，如發熱、腹瀉、直腸疼痛、肛周膿腫等，大多數是一過性，并不需要患者入院治療，表明耐受性好[22]。2017年進行的一項meta分析結果再次提示MSCs治療CD肛瘺愈合率較對照組高，差異有統計學意義（優勢比=0.21，P=0.000）[23]。

目前，采用自體或同種異體來源的骨髓或脂肪MSCs。治療CD肛瘺應用較多的是自體脂肪MSCs，大多數選擇單次瘺管內注射MSCs，另外，在未觀察到瘺管閉合的情況下選擇間隔6～8周后重復注射相同或更高細胞數量的MSCs，雖然目前MSCs治療CD肛瘺的細胞來源、細胞數量及治療間隔時間不同，但均能使難治性CD肛瘺患者獲益。目前，仍有幾項MSCs治療CD肛瘺的臨床研究正在進行中，期待能有更充分的證據明確MSCs治療CD肛瘺的療效及安全性。

總體而言，MSCs治療CD肛瘺的安全性較高，截至目前尚未見文獻報道由于MSCs自身造成的不良事件，常見不良事件為肛周疼痛、便血、發熱、腹痛、腹瀉、肛周膿腫等，大多數為一過性的，很少導致患者需入院治療或致殘，且這些不良事件與MSCs局部注射的操作程序（如瘺管的刮除、內部開口的封閉等）或疾病本身進展相關，而非MSCs本身所致。而外科手術常導致的并發癥如大便失禁并未見于MSCs治療的文獻報道。

考慮MSCs具有免疫抑制性，其是否具有潛在的致癌作用目前尚未明確。有動物研究顯示，MSCs可促進腫瘤生長[24-25]；但在目前已報道的臨床研究中尚未得到證實。MOLENDIJK等[19]報道了1例患者在MSCs局部瘺管內注射后15個月發生盲腸腺瘤，但考慮到MSCs在體內具有非常有限的壽命及患者有結腸癌家族史，且患者在入組初及治療后第12周時內鏡隨訪腸道活檢均未見腫瘤組織，因此，認為該腫瘤發生與遺傳因素相關而非由于MSCs治療所致。DE LA PORTILLA等[15]報道了1例患者在MSCs治療隨訪期間發現了子宮平滑肌瘤，但考慮到子宮平滑肌瘤為子宮的非癌性生長、育齡期女性發生率高且其癌變率極低甚至不發生癌變等特征，因此，在該臨床研究中也未揭示MSCs治療具有任何致癌風險。但需考慮到惡性腫瘤的發生、發展可能需在更長隨訪時間后才會明顯，一項隨訪時間長達4年的研究提示，MSCs無致癌風險[14]；但需考慮由于該研究納入樣本量少，且在各研究中對MSCs治療不良事件尚未具有標準化定義，因此，目前在評價安全性方面尚未達成統一標準，存在局限性。所以，在未來的臨床研究中需更大樣本量患者的長期隨訪，以進一步評估MSCs治療CD肛瘺的安全性。

4 MSCs治療CD肛瘺的研究方向

目前，關于MSCs治療CD肛瘺仍存在許多尚未解決的問題：（1）目前仍未知不同來源MSCs治療CD肛瘺的療效是否存在差異。有研究表明，脂肪、骨髓、臍帶MSCs之間存在免疫調節能力等的不同。雖然自體來源MSCs在體外具有相似的生長潛力和T淋巴細胞抑制特性，但自體MSCs增殖率較低，可能療效欠佳[26]，且需考慮自體MSCs體外擴增需一定的時間，可能會延誤治療。同種異體MSCs雖可及時獲得，但MSCs表達低水平的人類白細胞抗原，所以，同種異體MSCs仍有增加免疫原性的風險。（2）MSCs的最佳治療數量、治療時間間隔仍未有定論。有研究表明，中等細胞數量的MSCs可取得更高的瘺管愈合率，考慮系較高的MSCs細胞濃度可能導致較低的細胞存活率及降低了細胞功能，且MSCs達到一定細胞數量時可能表現出免疫原性，導致細胞被清除及失活率增加。（3）MSCs在治療CD肛瘺時因其與免疫抑制劑及生物制劑享有共同的靶目標，因此，聯合治療是否會相互影響尚需進一步驗證。有研究表明，MSCs暴露于一定濃度免疫抑制劑或生物制劑中并不影響其細胞存活率及其對單核細胞增殖的抑制作用，二者甚至具有協同作用[27]。但也有研究表明，高濃度硫唑嘌呤可降低大鼠骨髓MSCs的增殖，增加MSCs的凋亡、壞死[28]；且免疫抑制劑可能對活化MSCs的關鍵細胞因子IFN-γ的分泌造成影響。因此，MSCs是否與藥物聯合治療CD肛瘺尚有待于進一步明確。（4）未來臨床研究需在進一步明確MSCs治療CD肛瘺的機制基礎上設立更多的隨機對照試驗直接比較MSCs與免疫抑制劑、生物制劑、外科手術之間的療效差異。由于目前研究數據的局限性，未來研究中尚需考慮影響瘺管愈合的相關因素（如患者性別、年齡、瘺管直徑/長度、瘺管類型、CD病程長短、CD疾病活動指數等），在選擇合適的細胞數量、來源等的基礎上使CD肛瘺患者獲得最優化治療。

綜上所述，目前臨床藥物及外科手術對CD肛瘺的治療作用是有限的，由于MSCs具有抗炎、免疫調節、組織修復潛能等為難治性CD肛瘺的治療提供了新的希望。目前，已有多項臨床研究證實，MSCs對難治性CD肛瘺治療有效，且并未發現與本身MSCs治療相關的不良事件的發生，其療效佳及安全性可。但由于目前研究數據的局限性，未來的臨床研究需進行更多的隨機對照試驗以支持該結論。

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