誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在遺傳性血液病中的應(yīng)用與前景

劉 益，胡韋維 綜述，張鵬輝 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 400014)

異基因造血干細(xì)胞移植(HSCT)是目前根治遺傳性、惡性血液系統(tǒng)疾病的最重要的手段，然而配型成功率低、易發(fā)生急性移植物抗宿主病嚴(yán)重限制了其在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)具有細(xì)胞來源廣、可直接從患者自身獲得、在體外可誘導(dǎo)分化為造血祖細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。隨著基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，靶向修復(fù)患者iPSCs從而治療遺傳疾病已成為可能。本文就iPSCs在遺傳性血液病中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 iPSCs技術(shù)

干細(xì)胞是指一類具有自我更新能力與多向分化潛能的原始未分化的細(xì)胞群體，因其具有多向分化潛能，自其發(fā)現(xiàn)以來便備受臨床研究、再生醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，將已分化的體細(xì)胞通過重編程技術(shù)，使其重回干細(xì)胞狀態(tài)，一直是國(guó)內(nèi)外科學(xué)研究熱點(diǎn)。目前常用的重編程技術(shù)有3種：核移植(NT)、細(xì)胞融合、iPSCs技術(shù)。iPSCs技術(shù)是新近發(fā)明的重編程技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療、藥物篩選、毒理測(cè)試和研究疾病機(jī)制中。它具有細(xì)胞來源廣、可直接從患者體細(xì)胞中獲得的優(yōu)點(diǎn)，避免了倫理問題和免疫排斥反應(yīng)。伴隨基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，以用iPSCs為基礎(chǔ)，進(jìn)行基因靶向修飾日趨成熟。

2007年TAKAHASHI等[1]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc(OSKM因子)4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入人成纖維細(xì)胞中，獲得了一種在形態(tài)、增殖能力、表面抗原、端粒酶活性及干細(xì)胞相關(guān)基因表觀遺傳狀態(tài)均與胚胎干細(xì)胞相似的細(xì)胞，即iPSCs。隨著研究不斷深入，皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)層細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)肝細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞等已被證實(shí)可重編程為iPSCs；同時(shí)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4種轉(zhuǎn)錄因子可以被其他因子如Tet1、Sox3、I-Myc等替代[2-4]。去除高致癌的c-Myc，僅用Oct4、Sox2、Klf4 3種轉(zhuǎn)錄因子也可將體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs[5]。而更安全、便捷的化學(xué)小分子介導(dǎo)的體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程技術(shù)也在小鼠內(nèi)、中、外胚層細(xì)胞中取得成功[6-7]。為iPSCs治療人類疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

2 iPSCs在遺傳性血液病中的應(yīng)用

遺傳性血液病是由遺傳因素導(dǎo)致骨髓造血功能紊亂的疾病，造血干細(xì)胞移植是目前根治遺傳性血液病的重要手段，然而其來源有限、風(fēng)險(xiǎn)極大，臨床上常以對(duì)癥支持治療為主，大大降低了患者的生存年限和生活質(zhì)量。iPSCs的出現(xiàn)為遺傳性血液病的治療帶來了新思路，下面以范可尼貧血、鐮刀型細(xì)胞貧血病、地中海貧血為代表，簡(jiǎn)述iPSCs在遺傳性血液病中的應(yīng)用。

2.1范可尼貧血(FA) FA是一種先天性再生障礙性貧血，屬于常染色體隱性遺傳病，患者體細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑異常敏感，易發(fā)生染色體斷裂，致骨髓造血功能衰竭，出現(xiàn)全血細(xì)胞減少，常伴有先天性骨骼、心臟等畸形。長(zhǎng)期以來敲除FA基因的小鼠無法表現(xiàn)出人類骨髓三系下降的表型。2009年RAYA等[8]將包含VAV啟動(dòng)子的失活慢病毒轉(zhuǎn)入FA患者的成纖維細(xì)胞中進(jìn)行基因修復(fù)，并把包含OSKM 4種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入修復(fù)后的細(xì)胞中成功獲得了FA-iPSCs，同OP9細(xì)胞共培養(yǎng)后得到表型正常的紅系和髓系造血祖細(xì)胞，F(xiàn)A-iPSCs及分化成紅系或髓系造血祖細(xì)胞仍保留對(duì)DNA交聯(lián)劑敏感的特點(diǎn)，然而該實(shí)驗(yàn)證實(shí)iPSCs不能直接從FA患者體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得，必須先將患者體細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)后方可成功誘導(dǎo)。隨后，MUELLER等[9]證明低氧狀態(tài)下FA患者的體細(xì)胞可不經(jīng)基因修復(fù)直接誘導(dǎo)成iPSCs。OSBORN等[10]設(shè)計(jì)了針對(duì)FA基因15號(hào)外顯子1461C>A的sgRNA，利用CRISPR/Cas9修補(bǔ)患者的iPSCs，并證實(shí)該位點(diǎn)同源重組修復(fù)(HDR)概率高于非同源重組修復(fù)(NHEJ)，保證了基因編輯技術(shù)治療FA的精確性與安全性，為將來應(yīng)用iPSCs聯(lián)合基因修復(fù)技術(shù)治療該病奠定基礎(chǔ)。

2.2鐮刀型細(xì)胞貧血病(SCD) SCD是由點(diǎn)突變引起β珠蛋白第6位谷氨酸被纈氨酸替代，導(dǎo)致血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常，該病在世界范圍內(nèi)分布廣泛，具有高的致死性和發(fā)病率。2007年，HANNA等[11]將來自人源性SCD小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSCs，電轉(zhuǎn)正常β珠蛋白基因至iPSCs后，利用擬胚體(EB)技術(shù)將其分化為造血祖細(xì)胞，再注入回SCD小鼠中，最終在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到正常β珠蛋白基因表達(dá)。ZOU等[12]將包含了藥物篩選位點(diǎn)的loxP序列和錨定突變位點(diǎn)的鋅指核酸酶(ZFN)序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SCD患者(βS/βS)來源的iPSCs中，將1條突變的βS修復(fù)為正常的βA，得到了基因型為βA/βS的iPSCs，用Cre重組酶將loxP序列敲除并分化為紅細(xì)胞后，可得到25%～40%的正常βA表達(dá)。2016年LI等[13]找到一種更高效、安全的誘導(dǎo)SCD患者iPSCs方法，他們將EB病毒上的oriP/EBNA1區(qū)連致HDAd載體內(nèi)，解決了HDAd載體無法進(jìn)行重編程的問題，后將包含Oct4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin-28、p53shRNA序列的HDAd/EBV載體導(dǎo)入敲除病毒編碼區(qū)的腺病毒中，降低了腺病毒的毒性和免疫活性，大幅度提高了誘導(dǎo)效率，利用CRISPR/Cas9技術(shù)將針對(duì)SCD的sgRNA、Cas9蛋白及HDR單鏈寡核酸修復(fù)模板(ssODN)注入iPS細(xì)胞系中，修復(fù)效率高達(dá)67.9%(βA/[βS+βA])。修復(fù)后的iPS細(xì)胞行全基因組測(cè)序未發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因或其他致病基因改變，這為修復(fù)患者來源的iPSCs提供了快速、高效、安全的方法，也為治療其他基因突變疾病奠定基礎(chǔ)。

2.3β-地中海貧血 β-地中海貧血是常見的遺傳疾病，由β珠蛋白基因的缺失或突變引起，正常β珠蛋白的減少致使血紅蛋白不能攜帶足夠氧氣滿足機(jī)體代謝需要，中間型、重型患者常需終生輸血、祛鐵治療。2009年，YE等[14]成功獲得了β-地中海貧血患者成纖維細(xì)胞來源的iPSCs，同時(shí)還將來自β-地中海貧血胎兒產(chǎn)前基因篩查的羊水或絨毛細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSCs；最近，iPSCs也被證實(shí)可由β-地中海貧血患者的外周血或臍帶血細(xì)胞產(chǎn)生[15]，為日后治療胎兒重型地中海貧血提供了重要平臺(tái)。WANG等[16]用同源重組的方法修復(fù)了β-地中海貧血患者來源的iPSCs，將修復(fù)后的iPSCs定向分化為造血祖細(xì)胞并注入免疫缺陷鼠中，成功檢測(cè)到人正常β珠蛋白表達(dá)。MA等[17-18]先后應(yīng)用轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)和ZFN技術(shù)修復(fù)了β-地中海貧血患者iPS細(xì)胞株上β-珠蛋白的基因突變，修復(fù)后的iPSCs仍具有正常核型與多向分化能力，同OP9系統(tǒng)共培養(yǎng)后可向紅系分化，應(yīng)用外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ZFN修復(fù)前、修復(fù)后及向造血祖細(xì)胞分化時(shí)的β-地中海貧血iPSCs發(fā)現(xiàn)，基因突變多發(fā)生于重編程和基因修復(fù)過程中，與iPSCs的傳代次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間無關(guān)。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，iPSCs技術(shù)與CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合治療β-地中海貧血相關(guān)研究被不斷報(bào)道，LIU等[19]應(yīng)用CRISPR/Cas9聯(lián)合小分子化合物修正β-地貧iPSCs突變的β-珠蛋白基因，在保證修正后細(xì)胞保持正常核型與完全多能性的同時(shí)，提高了修正效率且無脫靶作用，為應(yīng)用CRISPR/Cas9聯(lián)合iPSCs治療血紅蛋白病提供了新方法。XIE等[20]將CRISPR/Cas9與piggyBac技術(shù)相結(jié)合，在修復(fù)β-地貧iPSCs后不殘留基因痕跡，為未來應(yīng)用iPSCs治療地中海貧血提供了有力依據(jù)。

3 展 望

iPSCs技術(shù)為治療血液系統(tǒng)疾病的提供了新的方向，但將其投入臨床治療尚需克服很多難關(guān)。首先，分化后的靶細(xì)胞移植入體內(nèi)后其分化方式和分化機(jī)制仍有待研究，同時(shí)iPSCs也存在著誘導(dǎo)效率低和安全性問題。隨著研究的進(jìn)一步深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過程中表達(dá)細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1、抑癌基因p53、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因INK4A抑制劑和某些特定的miRNA可提高誘導(dǎo)效率，而與體細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞更易轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細(xì)胞[21-23]。同時(shí)，細(xì)胞因子載體也由最初的逆轉(zhuǎn)錄病毒改為更安全的腺病毒、仙臺(tái)病毒、質(zhì)粒等。近年來，降低外源基因隨機(jī)整合的實(shí)驗(yàn)方法也獲得了成功，相信隨著對(duì)重編程過程和表觀遺傳狀態(tài)研究的逐步加深，人們可以找到更安全、高效的誘導(dǎo)方法[24]。iPSCs技術(shù)與基因編輯技術(shù)、基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)相結(jié)合后將為遺傳性血液病的治療開啟新的篇章。