紫花苜蓿細胞質雄性不育系和保持系SCAR標記的鑒定研究

周 仂， 王英哲， 譚 晶， 徐安凱，， 徐 博*

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院， 吉林 長春 130118； 2. 吉林省農業科學院， 吉林 長春 130118)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是起源于伊朗的一種優良牧草，也是我國種植面積最大的人工牧草。紫花苜蓿具有很強的雜種優勢，為利用好雜種優勢，需建立一套準確、高效的授粉控制系統，而雄性不育是紫花苜蓿利用雜種優勢的重要途徑之一。近年來，紫花苜蓿雄性不育機理也受到越來越多國內外學者的關注[1-4]。20世紀80年代，Kaul統計并發現雄性不育分為細胞核不育(Genic Male Sterility)和細胞質不育(Cytoplasmic Male Sterility)，細胞質不育也稱質-核互作雄性不育[5]。細胞核不育雖然由單基因調控，但是無法得到保持系，所以在生產應用中具有局限性。細胞質不育的不育性雖然是由不育的細胞質基因和相對應的核基因共同決定，但相比細胞核不育它可以找到保持系，適應于“三系”配套，在實際生產應用上有廣闊的前景[6]。Robins J G等利用轉基因手段獲得了紫花苜蓿雄性不育株，揭示了其不育性的細胞學機理，并進一步對其進行了相應的遺傳分析[7]。由于紫花苜蓿不育系和保持系在形態上無明顯差異，故無法通過形態學鑒定法在田間將二者區別開來，近年來隨著科學技術的快速發展，分子標記技術在紫花苜蓿不育機理研究中扮演著關鍵的角色。

近年來，簡單重復序列區域(Inter Simple Sequence Repeat，ISSR)分子標記技術已經被廣泛應用于植物的功能基因定位，遺傳多樣性分析等方面。ISSR標記技術由Zietkiewicz等人于1994年所建立[8]，能產生豐富的多態性位點來揭示種間及種內的遺傳差異[9]，操作簡單、快速、重復性好，屬顯性標記，適合于系統學[10]、遺傳多樣性[11-12]、品種鑒定[13]、構建遺傳圖譜[14-15]等研究。吳安迪等對在西南地區收集到105份材料進行了核型分析和ISSR分析，篩選出了5條引物，結果顯示相同地理區域的材料在聚類分析中多聚為一類[16]。

隨著現代研究手段的進步和理論研究的補充，AFLP、RAPD、RFLP、ISSR等分子標記技術都被應用于雜交種純度鑒定研究中[17-20]，但這些分子標記技術都存在不同的缺點。因此常將這些標記轉化為SCAR[21]、STS[22]等標記。1993年Paran和Michelmore發明并應用SCAR標記技術(Sequence Characterized Amplified Region)[23]。SCAR標記即特異序列擴增區，是以RAPD、RAGP、RFLP等分子標記為基礎對目標多態性DNA片段進行克隆和測序，設計一段長為20 bp～24 bp的引物，再PCR擴增。相比較RAPD、RGAP等標記，SCAR標記操作更簡單并且提高了分子標記的重復性與穩定性。王曉武等用RAPD標記與BSA法結合研究獲得與甘藍顯性雄性不育基因Ms連鎖的1個RAPD標記OT11900，并轉化為穩定的SCAR標記，為甘藍顯性雄性不育基因的輔助選擇提供了理論基礎[24]。陳沁濱等運用RAPD技術對洋蔥雄性不育系101A和同型保持系101B的基因組DNA進行研究分析，得到1個和洋蔥細胞質雄性不育基因連鎖的特異片段AK151400，并將其成功轉化為SCAR標記，為不育基因分子標記輔助選擇育種體系的建立奠定了基礎[25]。

盡管目前紫花苜蓿不育系的相關研究較多，但在紫花苜蓿細胞質不育機理的研究方面仍存在一些問題。本研究中通過已獲得紫花苜蓿細胞質雄性不育系材料和保持系材料，篩選與紫花苜蓿細胞質不育恢復基因高度連鎖的分子標記，并轉化SCAR標記，對方便快捷鑒定不育系種子純度提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料 在紫花苜蓿雄性不育系材料MS-GN-1A及其保持系材料MS-GN-1B回交四代后選育出優良的不育系及其保持系材料，取自吉林農業大學試驗田。將組配好的植物材料置于30℃下培養紫花苜蓿黃化苗7天，取樣品鮮樣1 g并提取各單株的植物線粒體DNA，構建紫花苜蓿不育系和保持系混合基因池，用于其多態性分析。利用不育系材料MS-GN-1A與保持系材料MS-GN-1B篩選培育出新的4組紫花苜蓿雜交種的不育系母本和同型保持系父本MS-JN-1A，MS-JN-1B，MS-JN-2A，MS-JN-2B，MS-JN-3A，MS-JN-3B，MS-JN-4A，MS-JN-4B用于SCAR標記的鑒定分析。

1.1.2引物 本試驗所用的100條ISSR引物為加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第9套引物，由上海生工有限公司負責合成。

1.1.3試劑 采購由北京康為世紀生物公司生產編號為CW2619的質粒提取試劑盒、2 × EsTaq酶;編號為EG101-2的DNA回收試劑盒、pEASYT1載體購自北京全試金生物公司。

1.2 方法

1.2.1提取線粒體和基因組 DNA在30℃下培養紫花苜蓿黃花苗7 d，取樣品鮮樣1 g根據試劑盒的提示提取線粒體DNA并用濃度為1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提取的DNA質量。

1.2.2ISSR-PCR擴增 本試驗所用的ISSR引物為加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第9套引物，由上海生工有限公司負責合成。經過我們之前的實驗結果，選擇針對紫花苜蓿線粒體DNA多態性好的引物，進行PCR擴增，使用20 μl體系，其中包括模板DNA 60 ng、dNTPs 0.4 mmol·L-1、引物0.6 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶 1.5 U和10×PCR Buffer 2 μL。擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。反應產物在1.5 %瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳約2 h，在凝膠成像儀上拍照并保存。

1.2.3紫花苜蓿不育系和保持系特異片段的克隆及測序 按照凝膠回收試劑盒的步驟進行多態性位點的切膠回收工作，回收的片段經檢測無誤后，連接到pEASY-T1克隆載體上，按照pEASY-T1 Cloning Kit說明書連接并轉化Trans1-T1感受態大腸桿菌，篩選陽性克隆。將陽性重組子培養后用質粒提取試劑盒提取并鑒定。之后將陽性重組子的質粒送上海生工進行序列測定，并通過NCBI數據庫進行比對分析。

1.2.4SCAR紫花苜蓿不育系和保持系 SCAR標記的引物設計及擴增檢測根據多態性片段的測序結果，設計PCR特異性引物，引物由上海生工有限責任公司合成，將ISSR-PCR特異性片段轉化為SCAR標記。根據設計引物的Tm值，確定其退火溫度。擴增程序為：94℃ 預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃延伸5min；4℃ 保存。以4對不育系和保持系線粒體基因組DNA為模板，用已設計的SCAR標記進行PCR擴增。反應結束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀拍攝照片并保存。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿線粒體DNA的提取與分析

根據上述提取DNA的方法提取紫花苜蓿的線粒體DNA，通過共8份材料提取得到線粒體DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA質量。結果如圖1所示，條帶整齊，顏色清澈透亮，提取的線粒體DNA滿足試驗要求用于ISSR-PCR擴增。

圖1 線粒體DNA電泳檢測Fig.1 Genomic DNA Electrophoresis Detection

2.2 紫花苜蓿不育系和保持系線粒體DNA的ISSR多態性分析

以本實驗之前優化的ISSR反應體系與篩選的引物為基礎進行ISSR分析，在圖2中可以看出，引物842和引物864的擴增圖譜中，保持系分別比不育系多出1條特異性片段，經反復驗證，其差異條帶均穩定出現，條帶大小都在500 bp左右。可以初步判斷，這2個特異性片段都只在保持系中出現，表明這2個片段可能與紫花苜蓿的細胞質不育基因相關。

圖2 不育系及與持系線粒體DNA部分ISSR引物篩選圖Fig.2 Mitochondrial DNA of sterile line and maintainerline screened by ISSR primers注：M：DNA標準；A：不育系；B：保持系Note:M:DNA Marker;A:sterile line;B:maintainer line

2.3 紫花苜蓿ISSR特異性條帶的測序和序列分析

將差異片段切膠并回收，連接轉化至大腸桿菌中，挑取陽性克隆搖菌并抽提質粒，經過M13F/R引物進行鑒定，其結果顯示，2個特異性片段均已成功連接至pEASY-T1載體上，可用于后續進行測序分析使用。

測序結果顯示2個片段的大小為457 bp和645 bp，將這2個序列利用NCBI數據庫的Blastn程序進行分析發現，這2個序列存在于紫花苜蓿的線粒體DNA中，不編碼任何已知功能蛋白，但可用于不育系和保持系的鑒定和雜交種篩選。

2.4 SCAR標記的轉化及鑒定

根據測序結果獲得的序列，設計一對特異性引物SCAR842-F(5’-GAGAGCCAAGCATCATTGATGGCG-3’)，SCAR842-R(5’-AGAGCTTGAGGGGTGGTGACCAT-3’)和SCAR864-F(5’-ATGATGGTGTAGTCAGGTTCAGTT-3’)，SCA R864-R(5’-ATGATGAACCGCTTACTCAACA-AGAA-3’)(圖3)。這2對特異性SCAR標記在所有4個保持系中均穩定擴增出1條特異性條帶，大小均與目的片段相同(圖4，圖5)。表明已經將ISSR-PCR分析中的多態性位點轉化為穩定的SCAR標記，可用于后續檢測和鑒定不育系和同型保持系和不育系種子的純度。

圖3 特異性片段序列信息Fig.3 The Sequence of Different DNA Bands

3 討論

在種類繁多的分子標記中，SCAR標記由于其優越的穩定、簡便、快速等性能脫穎而出，目前成為了分子標記在輔助選擇育種、種子純度分析等育種實踐中能直接應用的首選標記。[26]。周生茂等通過集群分離分析法(BSA)與相關序列擴增多態性技術(SRAP)獲得與苦瓜抗白粉病高度相關的SRAP標記EM20ME5并轉化成為SCAR標記SCRA-EM20ME5，該標記可用于苦瓜抗白粉病的分子標記輔助選擇[27]。張春寶等通過ISSR標記方法獲得大豆不育系與相應保持系間的特異片段ISSR829,并將其轉為SCAR標記，可用于今后大豆不育系的篩選和不育系種子純度鑒定[28]。王仁漢等在已獲得洋蔥雄性不育基因連鎖的SCAR標記OC2175的基礎上，對10份已知育性的洋蔥(5份不育系，5份保持系)和20份未知育性的洋蔥進行提取DNA并PCR擴增，發現SCAR標記OC2175可以區分洋蔥的不育系與保持系，初步驗證了該標記可用作于洋蔥雄性不育系材料的分子標記輔助選擇[29]。Shu-Fen Li等在麥芽稈和麝香草種鑒定出17個雄性特異性擴增片段，后經BLAST技術分析得到7種與反轉錄轉座子高度相關的連鎖序列并將其中2個轉化為SCAR-E52M11，SCAR-E54M11-2標記，結果顯示這2個標記可以有效地用于鑒定葎草的遺傳性、為進一步研究性染色體的進化提供研究基礎[30]。亞秀秀等將前人測序的11個與青海芥菜型油菜多室基因連鎖的AFLP標記轉化為SCAR標記，其中AFLP組合SA09MG08和SA10MC16被成功轉化，多態性良好，可利用該SCAR標記對青海芥菜型油菜苗期多室與二室鑒定，顯著提高了育種效率[31]。畢波等運用ISSR，AFLP和SRAP等技術對4個不同遺傳背景的紫花苜蓿進行褐斑病抗性的適用性驗證，驗證結果顯示適用性高的標記為感病標記ISSR22S450、抗病標記SRAPM3E3R169和ISSR20R750;適用性中等的標記有感病標記ISSR6S640和AFLP38S264,抗病標記AFLP1R206,AFLP16R185和ISSR834R450;適用性差的標記有感病標記ISSR11S750和ISSR22S640[32]。已有研究表明，SCAR標記在基因定位和分子標記輔助育種中已經開始普及，但在種子純度分析和不育系種子純度鑒定上卻鮮有報道，在紫花苜蓿中尚未見相關研究。

圖4 SCAR842對4對不育系和保持系進行PCR檢測電泳圖Fig.4 Four pairs of male sterile lines and maintainerlines detected by SCAR842注：樣量：50 μL；濃度：50 ng·μL-1；M：DNA標準；1A～4A：新培育的4個保持系材料；1B～4B：新培育的4個不育系材料Note:Sample amount:50 μL;Concentration:50 ng·μL-1;M:DNA Marker; 1A～4A:4 newly maintained lineage materials;1B～4B:4 newly cultivated CMS materials

細胞質雄性不育是指由細胞質不育基因與細胞核不育基因共同調控的一種不育類型。大量研究表明，細胞質雄性不育與線粒體基因組緊密相關，相比較而言與葉綠體基因組關系疏間[33]。利用ISSR分子標記技術，發現引物842和引物864的擴增圖譜中保持系分別比不育系多出1條特異性片段，經比對發現序列存在于紫花苜蓿線粒體基因上。推斷可能由于這2個序列在紫花苜蓿細胞質雄性不育系中缺失，而與其對應的保持系線粒體基因組中該片段正常，但是否此片段缺失造成不育系花粉敗育仍不能確定。

圖5 SCAR864對4對不育系和保持系進行PCR檢測電泳圖Fig.5 Four pairs of male sterile lines and maintainerlines detected by SCAR864注：樣量：50 μL；濃度：50 ng·μL-1；M：DNA標準；1A～4A：新培育的4個保持系材料；1B～4B：新培育的4個不育系材料Note:Sample amount:50 μL;Concentration:50 ng·μL-1;M:DNA Marker;1A～4A:4 newly maintained lineage materials;1B～4B:4 newly cultivated CMS materials

4 結論

本研究用100條ISSR引物進行篩選，結果顯示UBC842、UBS864引物在紫花苜蓿不育系及其同型保持系顯示出穩定特異性條帶，條帶大小分別為457 bp和645 bp。將特異性條帶克隆測序后轉化為SCAR特異鑒定標記，并對4對紫花苜蓿雜交種的不育系母本和同型保持系父本進行鑒定分析，發現該標記的重復性好，而且穩定，表明該標記可以作為紫花苜蓿不育系種子純度分析的候選標記，實際應用于紫花苜蓿不育系種子純度的鑒定，并且隨著紫花苜蓿參考基因組信息的補充，本研究中篩選出鑒定的SCAR標記在紫花苜蓿雄性不育機理的研究中將會發揮越發重要的作用。