山黧豆種子萌發特異性蛋白酶的分離純化及酶學性質研究

曲瑞紅， 劉鳳娟， 畢春曉， 宋瑤瑤， 胡 鑫， 徐全樂

(西北農林科技大學生命科學學院， 陜西 楊凌712100)

山黧豆(Lathyrussativus)，又叫家山黧豆，是山黧豆屬187種作物中的唯一栽培品種[1-2]。因為其良好的固氮能力、較高的蛋白含量、廣譜的抗逆性等優良生物學特征而成為干旱、半干旱地區重要的食用和飼用作物[3-5]。然而，內源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)的存在極大的限制了其推廣應用價值[6-7]。在山黧豆發育過程中，β-ODAP的合成與積累有兩個明顯的高峰：一個在種子萌發期，一個在種子成熟期[8]。代謝組學的研究表明，β-ODAP的積累與氮代謝、硫代謝、嘌呤代謝和嘧啶代謝等基礎代謝途徑密切相關[9]。尤其是尿嘧啶降解產生的β-丙氨酸可能是β-ODAP含量的調控信號[9]。

在種子萌發過程中，蛋白酶參與了儲藏蛋白水解等多種生理過程，為植物的生長發育提供氮源并在種子萌發的生化機制中扮演重要作用[10-12]。目前，許多重要的蛋白酶類已經得到了純化和鑒定[13-15]。例如，Jamir和Seshagirirao[16]從卡薩蒙納姜塊根中分離了一種半胱氨酸蛋白酶并對其生化性質和抗氧化特征進行了研究；Asano等[13]從大豆子葉分離了兩個半胱氨酸蛋白酶D3-α和β。在山黧豆中，Rajyalakshmi[17]發現金屬蛋白酶在干種子中活性較高，但在萌發種子中活性較低。Ramakrishna等[15]從山黧豆干種子中純化和鑒定了Zn2+依賴型的金屬蛋白酶。由于種子萌發過程中β-ODAP的大量積累與氮源密切相關，而蛋白酶類在儲藏蛋白的水解及氮源的提供中扮演重要作用，因而山黧豆種子萌發特異性蛋白酶的分離純化及性質研究對于加深β-ODAP積累的理解就顯得極其重要。

本研究擬檢測山黧豆種子萌發過程中的蛋白酶活性變化，并采用鹽析和離子交換層析等方法對蛋白酶進行分離純化。在此基礎上，分析不同金屬離子、pH、溫度及底物對蛋白酶活性的影響，為進一步研究蛋白酶活性與β-ODAP積累的關系奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 不同萌發時間山黧豆種子蛋白酶提取及明膠酶譜法檢測

取山黧豆(Lathyrussativus)干種子50粒，室溫浸泡2 h后于30℃，黑暗條件下萌發。分別取干種子及2，4，6，8，10 DAS(days after sowing)萌發種子200 mg于1 mL Tris-HCl(50 mM，pH7.0，含100 mM NaCl，1 mM EDTA)緩沖液中研成勻漿(冰浴)。室溫浸提20 min后，4 000 rpm×5 min取上清，利用考馬斯亮藍G250法檢測蛋白含量。

采用明膠酶譜法檢測上述提取蛋白酶活性[18]。向等蛋白量上述各樣品中加入2×SDS上樣緩沖液，并配置含0.04%明膠(Bio-Rad，USA)的10%聚丙烯酰胺凝膠，于4℃進行SDS-PAGE電泳(含β-巰基乙醇，上樣前無熱變性)。用蒸餾水洗滌凝膠2次以除去SDS，每次5 min；再將其置于pH5.5的檸檬酸磷酸緩沖液(含180 mM NaCl，2 mM DTT)中，30℃溫育過夜。凝膠經進一步考染、脫色后，用凝膠成像系統(Omega Lum G，Aplegen)觀察、記錄，并使用Quantity one 4.52對蛋白酶相對活性進行定量分析。

1.2 Ks分段鹽析

取山黧豆萌發6 d種子35 g，加50 mM Tris-HCl(pH7.0，含100 mM NaCl)100 mL研磨成勻漿。4℃，10 000 g×20 min后取上清測量體積并用紗布過濾，采用0～40%飽和度的NH4SO4(27.12 g)進行鹽析。15 min后，4℃，10 000 g×20 min，得沉淀1。上清測量體積后采用40～80%飽和度的NH4SO4(25.8 g)進行分段鹽析，操作同上述。4℃，10 000 g×20 min得沉淀2。沉淀1和2分別用10 mL 1×透析緩沖液(pH 7.0，40 mM磷酸鈉緩沖液，2 mM EDTA)溶解并注射到透析盒(Slide-A-Lyzer 3.5K，Thermo Scientific)。透析盒經薄膜封口，置于透析緩沖液中攪拌過夜。所有操作均在冰浴上進行。

從透析盒分別抽取上述溶液，置于15 mL離心管中，4℃，8 000 g×15 min。取上清經12%SDS-PAGE和明膠酶譜法檢測，其余備用。

1.3 離子交換層析

采用二乙氨基乙基纖維素(Diethylaminoethyl Cellulose)DE52(Whatman)裝柱，用60 mL透析緩沖液洗柱，平衡。上樣后用500 mM NaCl梯度洗脫并收集組分。各組分用明膠酶譜法(不含β-巰基乙醇，上樣前無熱變性)檢測蛋白酶純化情況。

1.4 Proteinase酶活的影響因素測定

用0～100 mg·L-1酪氨酸做標準曲線。參考Kembhavi等[19]方法檢測山黧豆蛋白酶活性，略有修改。將50 μL酶液添加到950 μL Tris-HCl(pH8.0，含2 mM CaCl2和0.5% 干酪素)，37℃溫育1 h后用0.5 mL TCA(20%)終止反應。室溫放置15 min后，13 000 g離心15 min，取上清在波長280 nm下測吸光度值。以水代替酶液設置對照，每個反應設三個重復。以每分鐘釋放1 mM Tyr為一個酶活單位(U)。

用1 mM EDTA，EGTA，尿素(Urea)及不同金屬離子CaCl2，CoCl2，FeCl3，MgCl2，MnCl2，ZnCl2等處理酶液，或利用不同pH(4～11)，不同溫度(30，40，50，60，70℃)，不同底物種類(牛血清白蛋白、干酪素、明膠、血紅蛋白、奶粉)等檢測山黧豆蛋白酶活性。

2 結果與分析

2.1 山黧豆種子萌發過程中蛋白質降解與蛋白酶活性檢測

利用10% SDS-PAGE分析山黧豆萌發不同時期的種子可溶性蛋白特征顯示：隨著萌發時間的延長，山黧豆高分子質量蛋白質(>31 KD)含量顯著降低，而較低分子質量蛋白質(≤31 KD)含量顯著增加(圖1A)。這說明在山黧豆種子萌發的過程中伴隨著高分子質量蛋白質的逐步水解。但是在萌發過程中可溶性蛋白含量變化不大。

進一步利用明膠酶譜法檢測山黧豆不同萌發時期種子蛋白酶活性顯示：除干種子外，不同萌發時期的山黧豆種子蛋白在聚丙烯酰胺凝膠藍色背景上均呈現透亮條帶，位于97 KD處(圖1B)。條帶亮度觀察及Quantity one定量分析表明，山黧豆種子在不同萌發時期(2～10天)的蛋白酶活性基本一致。這說明在山黧豆種子的萌發過程中伴隨著蛋白酶的激活，并造成了高分子質量蛋白質的逐步水解和低分子質量蛋白的積累。

圖1 不同萌發時期山黧豆種子可溶性蛋白(A)及蛋白酶活性(B)的電泳分析Fig.1 Soluble protein (A) and protease activity (B) analysis of Lathyrus sativus seeds with different days after sowing注：M：蛋白質分子質量標準，1：干種子，2：2 DAS，3：4 DAS，4：6 DAS，5：8 DAS，6：10 DASNote:M:protein molecular weight markers,1:dry seed,2:2 DAS,3:4 DAS,5:8 DAS,6:10 DAS

2.2 山黧豆種子蛋白酶的純化

取萌發6 d的山黧豆種子提取可溶性蛋白，采用0～40%和40～80%飽和度的NH4SO4進行分段鹽析。SDS-PAGE結果表明，大于31 KD的較高分子質量蛋白質在0～40%飽和度條件下析出較多，而小于31 KD的較低分子質量蛋白質在40～80%飽和度條件下析出較多(圖2A)。這說明對Ks鹽析法而言，相對分子質量越大的蛋白質越容易沉淀。因而，山黧豆蛋白酶在0～40%飽和度條件下更有可能析出；進一步明膠酶譜檢測也表明0～40%飽和度條件下析出的蛋白酶活性更高，大約占蛋白酶總活性的65%(圖2B)。

圖2 分段鹽析的SDS-PAGE(A)和明膠酶譜法(B)檢測Fig.2 Analysis of the products after fractional salting out with SDS-PAGE (A) and SDS-gelatin-PAGE (B)注：A：15% SDS-PAGE，B：12%SDS-PAGE。M：蛋白質分子質量標準；1，3，5：0～40%飽和度，2，4，6：40～80%飽和度；1～2：5 μL，3～4：10 μL，5-6：15 μLNote:A:15% SDS-PAGE,B:12% SDS-PAGE. M:protein molecular weight markers,1,3,5:0～40% NH4SO4 saturation,2,4,6:40～80% NH4SO4 saturation;1～2:5 μL，3～4:10 μL，5～6:15 μL

取上述0～40% NH4SO4飽和度鹽析蛋白，通過DE52陰離子交換柱層析進行進一步的分離純化。明膠酶譜分析顯示，在聚丙烯酰胺凝膠不含β-巰基乙醇時，蛋白酶條帶遷移率明顯變大(圖3)。說明山黧豆蛋白酶可能含有二硫鍵，在β-巰基乙醇存在時，二硫鍵被破壞，蛋白酶形狀可能呈現不規則狀態，電泳遷移率較小(圖1B，圖2B)；在無β-巰基乙醇時，蛋白酶結構更為緊密，泳動速度加快(圖3)。此外，在未結合蛋白中可見少量蛋白酶條帶；但在NaCl梯度洗脫時，蛋白酶條帶數目增多且清晰(圖3，14～17泳道)。收集上述蛋白酶液，用于進一步檢測蛋白酶活性的影響因素。

對于上述純化蛋白進行總蛋白含量、酶活力、酶比活力等檢測表明，經鹽析和離子交換兩步純化，山黧豆蛋白酶的純化倍數為6.58，蛋白得率為7.97%(表1)。略低于山黧豆金屬蛋白酶及其他物種半胱氨酸蛋白酶等的純化效率[15-16]。因而，本研究所獲山黧豆種子萌發特異性蛋白酶的分離純化條件還需要進一步優化。

圖3 經DE52陰離子交換柱層析純化蛋白酶的明膠酶譜檢測Fig.3 Analysis of the products after ion exchange chromatography of DE52 with SDS-gelatin-PAGE注：M. 蛋白質分子質量標準，1～10：未結合蛋白，11～22：洗脫蛋白Note:M:protein molecular weight markers,1～10:unbound proteins, 11～22:bound fractions

2.3 山黧豆種子蛋白酶活的影響因素

分別向酶反應液中添加1mM的Ca2+，Co2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+等不同金屬離子及蛋白酶抑制劑EDTA，EGTA和尿素等，檢測其對山黧豆蛋白酶活力的影響。結果表明，大部分金屬離子對酶活力的影響不大，說明山黧豆蛋白酶對金屬離子的耐受性較高。值得注意的是，添加Fe3+導致蛋白酶活性的顯著增加(圖4A)。此外，尿素和EDTA對蛋白酶活性有一定的抑制作用，EGTA則作用不大。

以牛血清白蛋白、干酪素、明膠、血紅蛋白和奶粉等為不同底物，檢測山黧豆蛋白酶活性變化。結果表明山黧豆蛋白酶對上述底物均表現出較高活性，其中血紅蛋白和明膠的活性最高，可能是最適反應底物(圖4B)。

取等體積酶液在不同pH條件下測定酶活，結果如圖4C所示。山黧豆蛋白酶在pH7時活性最大，但在其他pH條件下也能保持70%以上相對活性，表現出較好的酸堿耐受性。而且蛋白酶活性變化沒有表現為平滑曲線，略有起伏，可能是由于所純化樣品由多個蛋白酶混合造成的。

表1 山黧豆蛋白酶的分離純化Table 1 Purification of proteases from Lathyrus sativus

在不同反應溫度下，檢測山黧豆蛋白酶活力變化。由圖4D可知，蛋白酶在30～70℃范圍內活性較高，均能保持90%以上相對活性，其最適反應溫度為60℃(圖4D)。

3 討論

目前，僅在野豌豆、蕎麥等少數物種的干種子中發現了蛋白酶，但其生理功能尚不明確[10,20]。在種子萌發過程中，蛋白酶則廣泛存在，其主要類型是半胱氨酸蛋白酶，在儲藏蛋白的水解和轉運過程扮演重要作用[10]。大多數植物半胱氨酸蛋白酶都屬于papain(木瓜蛋白酶)家族和legumain(豆類天冬氨酸蛋白內切酶)家族[21]。Fischer等[22]在野豌豆中分析了papain家族和legumain家族的表達模式，在種子萌發早期檢測到了半胱氨酸蛋白酶的特異表達并參與了球蛋白的降解。本研究利用明膠酶譜法檢測了山黧豆種子萌發過程中蛋白酶的特異表達，并通過SDS-PAGE觀察和分析了種子萌發過程中高分子質量蛋白質的逐步水解和轉運。由山黧豆的缺素培養[8]及代謝組學[9]研究可知，氮/氮代謝是β-ODAP含量的關鍵影響因素。因而，山黧豆種子萌發特異性蛋白酶作用下的蛋白水解及轉運可能與β-ODAP在此過程中的大量積累關聯。

圖4 不同化合物(A)、反應底物(B)、pH(C)、溫度(D)對山黧豆蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of different factors of chemicals (A),substrates (B),pH (C) and temperature (D) on activities of proteases in Lathyrus sativus

4 結論

本研究檢測了山黧豆蛋白酶在種子萌發期的特異表達和在該時期種子高分子質量蛋白質水解中的作用，繼而從萌發6 d的種子中純化了該蛋白酶并對其基本酶學性質進行了研究。所獲山黧豆蛋白酶的純化倍數為6.58，得率為7.97%；該蛋白酶對金屬離子的耐受性較高，但受Fe3+影響較為顯著；此外，山黧豆蛋白酶對血紅蛋白和明膠的反應活性最高，其最適反應pH和溫度分別為pH7和60℃。本研究為進一步研究山黧豆種子萌發過程中蛋白質水解對其內源毒素β-ODAP積累的影響奠定了一定的基礎。