沙地生境不同苜蓿品種形態特征對低溫的響應及其與抗寒性關系

朱愛民， 張玉霞， 王顯國， 田永雷， 叢百明， 王 鑫， 候文慧

(1. 內蒙古民族大學， 內蒙古 通遼 028041； 2. 中國農業大學動物科技學院， 北京 100083；3. 內蒙古農業大學草原與資源環境學院， 內蒙古 呼和浩特 010018)

紫花苜蓿(MedicagosaticaL.)是一種多年生豆科(Leguminosaesp.)優質牧草[1]，具有很強的適應性，在我國大部分地區均有栽培種植，因其具有品質好、抗逆性好、并且產量高等優點，在我國畜牧業產業中占據了重要地位[2-3]。隨著國家糧改飼政策的調整，我國牧草的種植將不斷擴大，其中內蒙古自治區提出到2020年發展1 000萬畝節灌飼草地[4]。紫花苜蓿作為重要的冷季型牧草，在中國北方地區種植，越冬期的低溫脅迫是影響其安全越冬的主要環境因素[5-7]，低溫鍛煉期和越冬期寒害限制了北方草原牧區苜蓿的大規模生產，認識和研究紫花苜蓿越冬期抗寒機理，已經成為草原牧區研究熱點之一。

低溫鍛煉期苜蓿首先感受到低溫的是地上莖和葉，因此首先對低溫做出反應的是苜蓿的莖和葉，其次是苜蓿的地下根系。目前，關于低溫脅迫下苜蓿生長特性的研究很多，主要集中在苜蓿的莖、葉、莖葉比、根冠比、分枝數、株高、莖粗、秋眠芽數、根重、根長和葉片結構等方面。苜蓿低溫鍛煉期即秋末至初冬時期，在此期間日照短且溫度逐漸降低。CofFindaffer，Nittler[8-9]研究表明，不同苜蓿品種在適應低溫期間生長特性表現差異較大，抗寒性不同，耐寒能力強的苜蓿品種其莖分枝且匍匐生長。也有學者[10]研究發現苜蓿株高與抗寒性密切相關。崔國文等[11]在研究苜蓿生長特性與苜蓿抗寒性關系時表明，苜蓿葉片寬長比與苜蓿的越冬存活率呈顯著負相關關系，抗寒性高的苜蓿品種其葉片寬長比越大，越冬率也就越高，葉片寬長比越小則苜?？购跃驮降?，越冬率越低。

根系是牧草重要的吸收器官和合成器官，根系的生長狀況及其活力水平直接影響牧草的品質和產量。苜蓿作為宿根牧草，主要依賴根部的活力渡過越冬期，所以，苜蓿根系活力在很大程度上不僅能衡量其生長狀況，更能反映出植株抗寒性的強弱。研究表明，宿根花卉、“野牛草”(Buchloedactyloides)等植物在低溫脅迫下[12-14]，根系活力均與植物抗寒性呈顯著的相關關系。可見根系活力是衡量植物抗寒性的重要指標，并且實踐中應結合更多的抗寒指標，綜合評價和判斷植物抗寒性?？茽柷呱车囟竞洹⒔笛┹^少，選擇種植抗寒性強的苜蓿品種尤為重要。本研究通過對低溫鍛煉期沙地苜蓿各形態指標的測定，同時采用根系活力法協同Logistic回歸方程計算苜蓿半致死溫度，分析苜蓿的抗寒性與各形態指標的相關關系，為沙地苜蓿種質篩選、品種抗寒性鑒定及后續高抗寒性品種的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區自然概況

試驗地在內蒙古自治區赤峰市阿魯科爾沁旗草源合作社公司(116°21′120°58′ E，41°17′45°24′ N)，溫帶半干旱大陸性氣候。年平均氣溫0～6℃，≥10℃積溫3 000～3 200℃，無霜期140～150 d，年平均降水量350～400 mm，蒸發量是降水量的5倍左右，年平均風速34.4 m·s-1。試驗田為新開墾草地，土壤類型為沙土。

1.2 供試材料

供試材料見表1。

表1 紫花苜蓿品種及來源Table 1 Alfalfa varieties and sources

1.3 試驗方法

1.3.1大田試驗設計 大田小區布局及管理：采用隨機區組設計，小區試驗面積20 m2(5 m×4 m)，8個品種，3次重復，共設24個小區，小區之間設50 cm過道。所有小區底肥均施750 kg·hm2安琪酵母有機肥(有效活菌數≥0.20 億(g-1，有機質含量≥60.0%)，300 kg·hm2過磷酸鈣(P2O5≥14.0 %)，7 kg·hm2硫酸鉀(K2O≥50.0%)，60 kg·hm2尿素(N≥46.0%)。2016年8月4日播種，苜蓿播種量為22.5 kg·hm2，人工撒播，試驗田正常管理。低溫鍛煉期(2016年9月15日、10月1日和10月15日)進行相關生長指標的測定，10月15日測鮮草產量。

1.3.2低溫處理試驗設計 實驗室低溫處理：11月20號取樣，每小區取長勢一致的越冬器官若干(苜蓿根系)，于實驗室中4℃冰箱保存，備用。將備用1年生苜蓿越冬器官用蒸餾水沖洗干凈，每個品種平均分成7份，每份40株，每份越冬器官并排整齊擺放在厚度為3 mm，長、寬為30 cm×20 cm的純棉布上，包裹好，均勻噴灑30 ml蒸餾水，使棉布保持潮濕狀態，最后用長×寬為30 cm×30 cm錫箔紙包好。其中1份放入4℃恒溫冰箱作為對照，其余6份放入低溫冰箱(溫度誤差±1℃)進行處理，處理溫度分別為-10，-15，-20，-25，-30和-35℃。低溫程控箱設置為：以4℃為起點，先以4℃·h-1的速率升溫，到達設定溫度后保持8h，后以4 ℃·h-1的速率降溫，取出后置于4℃下保持12 h，然后進行根頸活力測定，指標測定時采用隨機取樣。

1.4 生長指標和根頸活力測定

苜蓿干草產量：選擇樣區內長勢一致的區域(避免取根樣的區域)，取2 m2樣方刈割測量，留茬高度5 cm，3次重復取其平均值，即為苜蓿干重。鮮草每次測產時，稱取200 g鮮草裝袋帶回實驗室，105℃殺青 15 min后，在 65℃下烘干至恒重，計算鮮干比(200 g/干草重量g×100%)，并進一步折算為每公頃干草產量。

株高：選擇樣區內長勢一致的區域，樣區內隨機測定10株，測量從地面至植株頂端的自然長度，10次重復取其平均值。

根頸粗：使用游標卡尺直接測量，最大根頸處(產生分蘗和秋眠芽處)，10次重復取其平均值。

秋眠芽：每小區取長勢一致的苜蓿10株，分別數出每株苜蓿根頸處長出的秋眠芽數，記錄并統計后計算平均單個苜蓿品種每株秋眠芽數。

分枝數：每小區取長勢一致的苜蓿10株，分別數出每株苜蓿根頸處長出大于15 cm的枝條，記錄并統計后計算平均單個苜蓿品種單株枝條數，即為苜蓿有效單株分枝數。

地上干物質量及根干重：每次刈割測定地上部株高時，同時挖取地下根系，連續5株，地上部分和地下部分分離，洗凈后放在烘箱里于65℃烘干后分別進行稱量。

根長：每次刈割測定地上部株高時，同時挖取地下根系，連續10株，用直尺測定苜蓿根系長度，記錄并計算平均單株根長。

根冠比(%)=(地上干物質量/地下干物質量)×100%。

根系活力測定用TTC染色法測定(張志安和陳展宗方法[15])：采用TTC氧化還原法，稱取根頸0.1 g，浸沒在由0.4% TTC和磷酸緩沖液(pH 7.0)各5 mL的溶液內，在37℃下暗保存4 h，此后加入1 mol·L-1硫酸2 mL停止反應。將根放入研缽中，加乙酸乙酯3～4 mL充分研磨，將紅色提取液移入刻度試管，用乙酸乙酯沖洗數次并定容至10 mL，用分光光度計在波長485 nm下比色，以空白試驗(將根先用硫酸處理)作參比測出吸光度，查標準曲線，即可求出TTC還原量。

根系活力(mg.g-1.h-1)=四氮唑還原量(mg)·[根重(g)×時間(h)]-1。

將各處理溫度下的相對根系活力分別用SPSS17.0軟件擬合Logistic方程[16-20]，求拐點溫度，即為低溫半致死溫度(LT50)。

1.5 數據分析

試驗數據用Microsoft Excel軟件處理、做圖和制作表格，SPSS17.0軟件進行方差顯著性分析，Logistic方程擬合和相關性分析。其中不同時期不同品種間株高、單株分枝數、秋眠芽數等指標數據采用方差顯著性分析，低溫處理下根頸活力值擬合Logistic方程。

2 結果與分析

2.1 沙地苜蓿對低溫的地上生長響應

2.1.1沙地苜蓿低溫鍛煉期株高變化 根據表2可知，低溫鍛煉期不同時間測定8個苜蓿品種株高變化存在差異。9月15日測定“肇東”和“公農1號”苜蓿品種植株高度顯著高于10月1日和10月15日測定株高(P<0.05)，說明“肇東”和“公農1號”苜蓿品種秋季休眠早；10月15日測定“東苜1號”和“草原3號”苜蓿株高顯著高于9月15日和10月1日測定株高(P<0.05)，說明“東苜1號”和“草原3號”秋季休眠較晚，10月15日仍繼續生長。

低溫鍛煉期8個苜蓿品種間株高變化不同。9月15日測定“公農1號”品種株高顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，達38.8 cm，苜蓿株高最低的是草原3號品種，為24.5 cm，顯著低于其他苜蓿品種(P<0.05)。10月1日測定和10月15日測定株高最高的均是“龍牧801”品種。

表2 沙地苜蓿低溫鍛煉期株高變化Table 2 Changes in plant height of alfalfa during cold hardening in sandy land/cm

注：不同小寫字母表示差異顯著性水平P< 0.05，”/”左邊表示同列相同時期測定不同苜蓿品種間差異顯著性，右邊表示同一品種不同時間測定差異顯著性，下同

Note:The different letters indicate significant differences at the 0.05 levels，on the left side of”/” indicate significant difference of the same column between different alfalfa varieties that determined at the same time，on the right side of”/” indicate significant difference between the same varieties that determined at the same time,the same as below

2.1.2沙地苜蓿低溫鍛煉期分枝數變化 低溫鍛煉期沙地苜蓿單株分枝數呈先增加后減少的趨勢(表3)。10月1日測定8個苜蓿品種單株分枝數均高于9月15日測定分枝數，但未達到差異顯著水平(P>0.05)。除“龍牧801”和“肇東”苜蓿品種外其他苜蓿品種9月15日和10月1日測定單株分枝數均顯著高于10月15日測定單株分枝數(P<0.05)，說明10月1日后苜蓿進入休眠，不產生分枝，且部分枝條凋零干枯減少。

低溫鍛煉期8個苜蓿品種間單株枝條數變化不同。如表3所示，9月15日測定“草原2號”苜蓿單株分枝數顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，達到每株2.58個。10月1日測定苜蓿單株分枝數較多的是“草原2號”、“龍牧801”和“東苜1號”品種；10月15日測定“龍牧801”苜蓿品種單株分枝數顯著多于其他苜蓿品種(P<0.05)。

表3 沙地苜蓿低溫鍛煉期單株分枝數變化Table 3 Variation of branch number of alfalfa during cold hardening period in sandy land/個·株-1

2.1.3沙地苜蓿低溫鍛煉期地上干物質量變化 如表4所示，低溫鍛煉期沙地苜蓿地上干物質量變化存在差異。“龍牧801”、“公農一號”、“農菁1號”和“農菁8號”苜蓿地上干物質量隨測定時間的推遲呈逐漸增加的趨勢。9月15日測定“草原2號”苜蓿地上干物質量顯著大于10月1日和10月15日測定干物質量(P<0.05)。10月1日測定“肇東”、“東苜1號”和“草原3號”苜蓿地上干物質量顯著高于9月15日和10月15日測定干物質量(P<0.05)。

低溫鍛煉期8個苜蓿品種間地上干物質量變化不同。9月15日測定“龍牧801”苜蓿品種地上干物質量最大；10月1日測定地上干物質量較大的苜蓿品種是“龍牧801”、“東苜1號”和“農菁8號”，分別為5.05 g、4.98 g和4.65 g；10月15日測定“農菁8號”苜蓿地上干物質量最大。

表4 沙地苜蓿低溫鍛煉期地上干物質量變化Table 4 Dry matter quality changes of alfalfa above ground during cold hardening period in sandy land/g·5株-1

2.1.4苜蓿品種干草產量比較 如圖1所示，“肇東”和“農菁8號”苜蓿品種干草產量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，分別達到2 681.33 kg·hm-2和2 645.01 kg·hm-2，干草產量最低的是“草原3號”苜蓿，為2 248.08 kg·hm-2，顯著低于“龍牧801”、“肇東”、“東苜1號”、“農菁1號”和“農菁8號”，其中“龍牧801”、“東苜1號”、“草原2號”、“公農1號”和“農菁1號”苜蓿品種間干草產量無差異顯著性(P>0.05)。

圖1 苜蓿品種干草產量比較Fig.1 Comparison of hay yield of alfalfa varieties注：A：龍牧801；B：肇東；C：東苜1號；D：草原2號；E：草原3號；F：公農1號；G：農菁1號；H：農菁8號不同小寫字母表示不同品種間差異顯著水平P<0.05，下同Note:A:Longmu No.801;B:Zhaodong;C:Dongmu No.1;D:Caoyuan No.2;E:Caoyuan No.3;F:Gongnong No.1;G:Nongjing No.1;H:Nongjing No.8 Different lowercase letters indicate significant difference among different varieties at the 0.05 level,the same as below

2.2 沙地苜蓿對低溫的地下生長響應

2.2.1沙地苜蓿低溫鍛煉期秋眠芽數變化 低溫鍛煉期苜蓿休眠芽數隨時間的推移呈現增加的趨勢(表5)。但是不同品種休眠芽的變化存在差異。9月15日測定“公農1號”和“農菁1號”苜蓿品種秋眠芽數顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，分別是單株2.67個和2.50個。10月1日測定“草原3號”、“草原2號”和“東苜1號”苜蓿秋眠芽數相對較多，分別為單株4.08個、3.96個和4.00個。10月15日測定“龍牧801”和“農菁1號”苜蓿秋眠芽數顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，分別為單株4.83個和4.91個。

2.2.2沙地苜蓿低溫鍛煉期頸粗變化 根據表6可知，低溫鍛煉期不同時間測定苜蓿根頸粗度變化趨于一致。10月15日測定8個苜蓿品種頸粗均大于10月1日測定頸粗，其中“草原3號”、“公農1號”、“農菁1號”和“農菁8號”頸粗達到差異顯著水平(P<0.05)，且10月15號測定頸粗均顯著高于9月15日測定頸粗(P<0.05)，除“草原3號”苜蓿品種外其他苜蓿10月1日測定頸粗均顯著高于9月15日測定頸粗(P<0.05)。三次測定“龍牧801”苜蓿品種根頸均最粗。

2.2.3沙地苜蓿低溫鍛煉期根重變化 低溫鍛煉期沙地苜蓿根重呈增加的趨勢(表7)。除“草原2號”苜蓿品種外10月15日測定其他苜蓿品種根重均顯著大于10月1日測定的根重(P<0.05)，除“肇東”苜蓿品種外10月1日測定其他苜蓿品種根重均顯著大于9月15日測定的根重(P<0.05)。

低溫鍛煉期8個苜蓿品種間根重變化不同。9月15日測定“公農1號”、“草原2號”、“龍牧801”和“農菁8號”苜蓿品種根重顯著高于其他苜蓿(P<0.05)。10月1日測定“東苜1號”苜蓿品種根重最大，“肇東”和“農菁1號”苜蓿根重相對較低。10月15日測定“草原3號”苜蓿根重最大，為3.46 g，顯著大于其他苜蓿品種(P<0.05)。

表5 沙地苜蓿低溫鍛煉期秋眠芽數變化Table 5 Changes in the number of dormant buds during the cold hardening period of alfalfa in sandy land/個·株-1

表6 沙地苜蓿低溫鍛煉期頸粗變化Table 6 Changes in neck diameter of alfalfa duringcold hardening in sandy land/ mm

表7 沙地苜蓿低溫鍛煉期根重變化Table 7 Root weight changes during cold hardening of alfalfa in sandy land/ g

2.2.4沙地苜蓿低溫鍛煉期根長變化 根據圖2所示，低溫鍛煉期沙地苜蓿根長增加，且不同苜蓿品種在不同時間段根長增加幅度不同。9月15日至10月1日苜蓿根長增加達到差異顯著水平的品種是“龍牧801”、“肇東”、“草原2號”、“草原3號”、“公農1號”和“農菁8號”(P<0.05)。10月1日至10月15日8個苜蓿品種根長均增加，“肇東”、“東苜1號”、“草原2號”和“農菁1號”增加差異達到顯著水平。

2.2.5沙地苜蓿低溫鍛煉期根冠比變化 如圖3所示，8個苜蓿品種低溫鍛煉期根冠比變化趨于一致，均呈增加趨勢，且不同品種間根冠比增加幅度不同。9月15日測定除“農菁1號”外，其他苜蓿品種根冠比均顯著低于10月1日測定的根冠比(P<0.05)，其中根冠比較高的是“草原3號”苜蓿，為0.50。10月1日測定根冠比最高的是“農菁8號”品種，達到0.66，除“公農1號”和“農菁8號”外，其他苜蓿品種根冠比均顯著低于10月15日測定的根冠比(P<0.05)。10月15日測定根冠比最高的是“草原3號”苜蓿品種，為1.32，其次是草原2號，為1.13，根冠比相對較低的是“龍牧801”品種和“公農1號”品種。說明低溫鍛煉期沙地苜蓿地上生物量部分向地下轉移，地下生物量明顯增加，根冠比增大。

圖2 沙地苜蓿低溫鍛煉期根長變化Fig.2 Root length changes during cold hardening of alfalfa in sandy land

圖3 沙地苜蓿低溫鍛煉期根冠比變化Fig.3 Change of root and crown ratio of alfalfa during cold hardening in sandy land

2.3 根頸活力法協同Logistic回歸方程對8個苜蓿品種半致死溫度分析

根據在不同低溫脅迫下苜蓿根頸活力變化值求得logistic回歸方程，低溫半致死溫度，相關系數(r)及顯著性(Sig.)見表8。8個苜蓿品種顯著性均小于0.01，相關系數均大于0.9，達到差異極顯著水平；“東苜1號”苜蓿半致死溫度最低，為-19.2℃，其次是“草原3號”苜蓿，其中“草原2號”和“農菁8號”品種苜蓿半致死溫度均高于-15℃，最低半致死溫度與最高半致死溫度相差4.76℃；根據根頸活力法協同Logistic回歸方程得半致死溫度對8個苜蓿品種耐寒性排序為，“東苜1號”>“草原3號”>“農菁1號”>“公農1號”>“龍牧801”>“肇東”>“農菁8號”>“草原2號”。

2.4 苜蓿半致死溫度與各形態指標相關性

根據表9可知，苜蓿半致死溫度與株高、莖粗、分枝數、地上干物質和根長呈正相關關系，但均未達到顯著水平(P>0.05)，與秋眠芽數、根重和根冠比呈負相關關系，其中與根重的相關性達到差異顯著水平(P<0.05)。此外苜蓿株高與分枝數、莖粗與地上干物質量以及根長與秋眠芽數呈顯著正相關關系(P<0.05)。其他生長指標間無顯著相關性(P>0.05)。

表8 8個苜蓿品種低溫處理下的根頸活力回歸方程及半致死溫度(LT50)Table 8 Logistic equation between temperature and vitality of root neck of 8 alfalfa varieties and their LT50.

注：**表示在0.01水平下差異顯著

Note:** indicates significant difference at the 0.01 level

注：*表示在 0.05 水平上顯著相關

Note：* indicate significant correlation at the 0.05 level

3 討論

因地制宜的選擇苜蓿品種是保證苜蓿安全越冬的首要條件，在中國北方寒冷地區，品種的選擇應首先考慮抗寒性。因此根據生產目標、當地氣候條件、現場調查、引種試驗等多方而因素綜合分析，確定適宜品種，才能保證苜蓿安全越冬[4]。本試驗在北方科爾沁沙地對8個苜蓿品種低溫鍛煉期生長特性調查表明，“肇東”和“公農1號”苜蓿品種植株在9月下旬后不在繼續生長，株高呈降低趨勢，說明“肇東”和“公農1號”苜蓿品種秋季休眠早，低溫鍛煉期3次測定“草原3號”苜蓿株高均明顯低于其他苜蓿品種，說明當“草原3號”苜蓿株體接收到低溫脅迫后逐漸進入休眠，可能具有較強的抗寒性。苜蓿頸粗為適應逐漸降低的溫度表現為顯著增粗的變化。Schwab等[21]研究表明，苜蓿根頸粗度與其抗寒性具有顯著正相關關系，本試驗9月15日和10月1日測定“龍牧801”苜蓿品種根頸粗度均顯著大于其他苜蓿，因此可推斷“龍牧801”苜蓿品種抗寒性較強。

王英哲等[22]在研究苜蓿引種和生產性能比較中表明不同紫花苜蓿品種分枝數表現不同，本試驗表明苜蓿單株分枝數9月15日和10月1日相比變化不顯著(P>0.05)，之后單株分枝數呈減少趨勢，且不同品種間苜蓿單株分枝數不同，與王英哲等[23]研究結果一致。10月1日后北方地區溫度逐漸降低，抗寒性強的苜蓿品種地上物質量的積累停滯，部分營養向根系轉移，“肇東”、“東苜1號”和“草原3號”苜蓿地上干物質量在10月1日后顯著降低，說明此3種苜蓿對低溫較敏感；“農菁8號”苜蓿品種干草產量顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，干草產量最低的是“草原3號”苜蓿，說明“農菁8號”品種對低溫的敏感度低，在逐漸降低的溫度變化環境中，地上生物量積累較其它苜蓿品種高，而“草原3號”苜蓿品種則逐漸進入休眠。

苜蓿秋眠芽數越多則翌年苜蓿的分枝越多，產量亦會提高，秋眠芽的多少與越冬的關系尚不明確。本試驗表明苜蓿根頸秋眠芽數隨逐漸降低的溫度表現為顯著增加的變化(P<0.05)，相關性分析表明苜蓿秋眠芽數與頸粗呈顯著正相關關系，其中10月15日測定“龍牧801”和“農菁1號”苜蓿秋眠芽數顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，說明“龍牧801”和“農菁1號”苜蓿生產性能高于其他苜蓿品種。陶雅、陳積山、吳新衛、王運濤等[24-27]研究發現苜蓿根頸粗度的大小與苜蓿的抗寒性呈顯著的正相關關系，本研究與其研究結果一致，本研究表明隨季節性溫度的逐漸降低，苜蓿根重明顯增加，根長增長，根冠比增大，10月15日測定根頸粗度最大的苜蓿品種是“龍牧801”，“草原3號”苜蓿根最重，推斷兩苜蓿品種抗寒性較強。

受不同低溫脅迫后苜蓿植株根頸活力會明顯下降，且溫度越低根頸活力越弱，根頸活力法協同Logistic回歸方程表明，“東苜1號”品種抗寒性較“草原3號”強，“農菁8號”品種較“草原2號”抗寒性強；8個紫花苜蓿品種抗寒性排序為“東苜1號”>“草原3號”>“農菁1號”>“公農1號”>“龍牧801”>“肇東”>“農菁8號”>“草原2號”；通過對半致死溫度與苜蓿各生長指標做相關性分析表明，苜蓿半致死溫度與苜蓿根重呈顯著負相關關系(P<0.05)，即苜蓿根系越重其半致死溫度越低、抗寒性越強，而與其他生長指標無顯著相關關系(P>0.05)。

4 結論

低溫鍛煉期“東苜1號”、“草原3號”和“公農1號”對低溫較敏感，苜蓿休眠較早；科爾沁沙地可選擇種植“東苜1號”、“草原3號”等抗寒性較強的苜蓿品種。