食品微生物能力驗證的重要因素

◎ 雷蘭蘭

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

能力驗證（Proficiency Testing）是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構能力的活動，也是認可機構加入和維持國際相互承認協議（MRA）的必要條件之一。對于已經獲得或者申請CNAS認可的實驗室，參加能力驗證活動是強制性的，CNAS-AL07-CNAS《能力驗證領域和頻次表》中要求食品微生物領域每年至少參加一次能力驗證，談談參加食品微生物學能力驗證的體會。

1 樣品前處理

1.1 制訂檢驗方案

收到樣品后，先按照說明將樣品在適當的條件下進行存放，一般微生物樣品多是冷藏和冷凍保存。再指定人員編寫該樣品考核的檢驗方案，方案中需包括進行檢驗的具體時間和結果上報的時間，以及人、機、料、法、環、測6個要素，即進行檢驗的人員、用到的設備儀器、試劑耗材及其數量、具體標準方法、進行檢驗的具體實驗室和檢驗過程的具體操作。對于作業指導書有說明的部分，嚴格按照作業指導書的規定進行操作，對于作業指導書沒有規定的操作，則按照本實驗室通過認可的現行有效的常用標準規范進行操作。

1.2 樣品復溶

使用作業指導書規定的稀釋劑，按照規定進行復溶和轉移以及潤洗，并且在規定的時間內完成該過程。由于有些細菌繁殖速度較快，20 min即可增殖一代，所以要在規定的時間內完成樣品復溶及第一梯度稀釋液的制備。同時，將剩余的復溶液以及第一梯度稀釋液保存在4 ℃左右的冰箱中，以便于第一次檢驗結果出現問題不能計數時能夠進行第二次檢驗。建議復溶過程由兩人進行，一人操作，另外一人監督，若發現問題，及時糾正。

1.3 定量檢驗

對于定量樣品，最重要的一點是做好稀釋度的選擇。稀釋度越高，檢驗人員的工作量越大；但是，稀釋度太低，則可能出現所有平板上的菌落數多不可計，最終無法報告結果。對于國內的能力驗證和盲樣考核，如果作業指導書上沒有建議稀釋度的選擇，那么一般稀釋到10-5即可，如果作業指導書上有建議稀釋度，那么就至少要稀釋到指定稀釋度。例如，本實驗室曾經做過大腸菌群的盲樣考核，作業指導書上建議稀釋至10-7，實際操作時，本實驗室檢驗人員稀釋至10-8。結果表明，在合理計數范圍內的稀釋度為10-6。每一個樣品，保證至少由兩人同步檢驗，最后綜合比對兩人的結果，以減少人員誤差。每一個項目，除標準規定所用到的培養基之外，盡量同步使用測試片或者其他等效培養基進行檢驗，用來作為計數參考，但是最終報告結果時，還是應以標準規定培養基上的結果為準。由于玻璃平皿可能存在不平整的情況或者玻璃不夠純凈進而影響平板計數，建議使用一次性的塑料平皿，但是同一個樣本盡量使用不同包裝中的平皿，防止平皿中抑菌物質殘留而影響菌落生長。

2 菌落總數

標準規定是在培養至（48±2）h進行計數，但是在實際檢驗過程中，如果樣品中添加的菌株在兩種以上，其中一種生長繁殖速度快且有蔓延趨勢，另外一種生長繁殖速度慢。在培養至48 h進行計數時，發現其中一種菌落蔓延重疊，且覆蓋另外一種菌落，導致無法完全計數平板上的菌落。對于這種情況，則應該在培養至12、24、36、48 h分別查看平板上的菌落生長情況和數量并記錄，以防止菌落蔓延和生長差異導致不能正確計數。如本實驗室在做菌落總數能力驗證時，發現在培養至12 h時，一種菌落直徑已達到2～3 mm，培養至48 h時，該種菌落直徑已達到5～10 mm；而另外一種菌落生長繁殖速度慢，培養至12 h時，不能觀察到任何菌落痕跡，培養至48 h時，可以觀察到直徑不到1 mm的細小菌落[1]。

2.1 大腸菌群

目前，大腸菌群的能力驗證或盲樣考核多為平板計數法，對于大腸菌群的檢驗，還需要注意的是BGLB驗證的過程，標準中說明選取平板菌落數在15～150 CFU的平板，挑取典型和可疑菌落共計10個 BGLB進行發酵驗證試驗，但是并未說明每個平板挑取10個還是兩個平板總共挑取10個。故提出這樣的建議，如果平板上菌落形態單一，則兩個平板總共挑取10個進行驗證，若平板上菌落形態差異較大，則最好是每個平板上挑取10個菌落進行驗證，并且對典型和可疑菌落按照比例挑取驗證，最終計算結果時，還需要分別計算典型菌落的陽性率和可疑菌落的陽性率。

2.2 霉菌和酵母菌

無論是食品還是化妝品，或者是食品包材，對于霉菌和酵母菌都是同一種培養基進行同步檢驗，報告結果時就需要按照作業指導書的規定，兩個項目分開報兩個結果，或者兩個項目合計最終報告一個結果。在檢驗的過程中，由于霉菌生長速度較快，最好在培養第二天開始，每天查看平板上的菌落數并記錄，以防止個別霉菌生長太快而最終覆蓋平板影響計數結果。在觀察平板上的菌落數時，盡量不要拿動平板，以防止霉菌孢子飛散。

2.3 金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌

目前，對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌這兩個項目的考核，多為平板計數法，檢驗方法也類似，都是平板涂布法，加入平板的樣液分別為0.3、0.3、0.4 mL。需要注意的是，涂布用的平板在制備凝固之后，最好放在超凈工作臺上，打開皿蓋，開啟風機，吹上2～4 h，讓平板盡量干燥，加入樣液后也才能更好地吸收。

3 定性檢驗

定性檢驗過程一般分為樣品復溶、前增菌、選擇性增菌、平板分離、染色鏡檢以及生化鑒定。在樣品復溶后，取規定數量的復溶液加入增菌液中進行增菌以及后續試驗。由于一般定性檢驗的樣品中會加入一種或者幾種與目標菌相似的干擾菌，有的干擾菌在增菌液中生長旺盛，甚至超過目標菌而成為增菌液中的優勢菌，最后導致平板劃線不能分離到目標菌。建議在將復溶液加入增菌液中按照標準規定步驟進行增菌及后續試驗時，用接種環從剩余的復溶液中挑取菌液，劃線于分離平板進行培養，若發現可疑菌落，則可直接進行后續鑒定。

3.1 平板劃線分離

平板劃線分離是定性檢驗的一個關鍵步驟，好的平板劃線操作能夠分離出足夠的單菌落，用于后續的檢驗，平板劃線不過關的話，甚至可能導致不能分離出單菌落，結果漏檢。因此，每位參加微生物定性檢驗的人員在需要進行平板劃線操作時，一定要謹慎操作，務必保證通過劃線操作分離出足夠的單菌落。

3.2 分離用瓊脂平板

在標準規范和實驗室能力允許的條件下，盡量使用兩種或以上的選擇性瓊脂平板來劃線分離可疑菌落，以保證不漏檢。同時，最好將顯色培養基作為分離平板之一，雖然顯色培養基成本較高，但是其中含有針對目標菌的特異性成分，因此對目標菌均具有良好的分離效果，能夠很容易判定是否有目標菌存在，減少檢驗員的工作量。

3.3 生化鑒定

通過平板劃線操作分離到可疑菌落時，則需要進行鑒定。有些檢驗方法標準也規定除了傳統的生化鑒定外，可以使用微生物全自動生化鑒定系統。但是，需要注意的是，全自動生化鑒定系統的數據庫里的數據有限，有時候并不能識別出某種細菌，因此建議還是要以標準中規定的傳統生化鑒定為鑒定依據。在進行傳統的生化鑒定時，最好先將可疑菌落接種至相應的營養瓊脂或胰酪胨大豆蛋白瓊脂等非選擇性瓊脂平板上進行純化培養。一方面，可以對可疑菌增殖；另一方面，因為選擇性平板一般含有選擇性抑菌成分，甚至也會對目標菌造成傷害，受到傷害的目標菌再拿去進行生化鑒定，其生化特征便沒有代表性，結果可能是假陰性而導致漏檢，而純化培養可以使菌的活性與特性得到恢復，以便得到更準確的生化鑒定結果。

3.4 對照菌株

在進行考核樣品檢驗的同時，還需要準備好陽性對照菌株和陰性對照菌株，以備在染色鏡檢和生化鑒定時作為對照參考。

3.5 血清學試驗

有少量的檢驗標準中將血清學鑒定試驗作為必做項目，如GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》規定對生化鑒定符合沙門氏菌特征的可疑菌還需進行多價菌體抗原（O）和多價鞭毛抗原（H）。在進行血清學試驗時，除了選擇質量可靠的血清產品，還應該對每批次血清產品進行技術性驗收，同時使用陰性菌和陽性菌做好對照試驗。對于待測菌，也應該選擇標準中規定的特定瓊脂培養物來進行血清學試驗。

4 報告結果

檢驗完成后則是分析數據，報告檢驗結果。不管是定量檢驗還是定性檢驗，除了按照標準規定，還應該按照能力驗證所附的結果報告單的要求報告結果。填好結果報告單后，校核人員需要仔細查看，防止錯誤出現。

5 結語

目前看來，現在能力驗證的難度越來越高，檢驗的時間也越來越少，基本上就是按照標準規定的一個檢驗周期再加上兩三天的時間。而這額外的兩三天時間里，前期準備大概需要一兩天時間，報告結果需要一天時間。因此，需要參加能力驗證的實驗室，工作人員一定要提前備好相關設備、試劑和耗材，保證實驗室所參加的能力驗證能夠正常進行。