基因測序技術在食品檢測領域的應用

◎ 王敏峰

（上海市酒類產品質量檢驗中心有限公司，上海 200081）

1 基因測序技術

在分子生物學研究中，DNA序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前，用于測序的主流技術有2類：①傳統測序技術，或稱為第一代測序技術，以雙脫氧鏈終止法（Sanger測序法）為代表。②近幾年發展起來的下一代測序技術（NGS測序技術），又被稱為高通量測序技術，其測序原理有邊合成邊測序、單分子測序和納米孔測序。具體來說，邊合成邊測序（也稱為第二代測序技術）以Roche公司的454技術，Illumina公司的Solexa、Hiseq技術和ABI公司的Solid技術為代表；單分子測序（也稱為第三代測序技術）以Helicos Bioscience公司的HeliScope遺傳分析系統和Pacific Biosciences公司的PacBio RS單分子實時測序系統為代表；納米孔測序（也稱為第四代測序技術），Oxfold Nanopore Technologies 公司的GridION和MinION等為代表[1]。

測試技術的飛速發展，使檢測通量有了革命性的改進，同時大大降低了測序成本。此外，消費者對于食品安全越來越重視，無論是生產者、消費者還是監管檢測機構，都需要開發更精確、更高效的檢測方法，基因測序技術正迎合了這樣的需要，故而，基因測序技術與食品檢測領域的結合也應運而生。

2 基因測序技術在食品檢測中的應用

2.1 食品中成分的檢測

任何人為或者意外導致的食品摻假和污染都是不可接受的，但各種食品原料（如各種禽畜肉類、水產類）間巨大價差所帶來的豐厚利潤，使得此類事件層出不窮，國內國外都屢見不鮮。食品中摻入的其他未標注成分也增加了食品過敏的風險，從國內的“掛羊肉賣鴨肉”到歐洲的“馬肉風波”，各種食品危機、食物過敏和食品欺詐的發生將摧毀消費者對于食品安全的信心，也傷害了行業的健康發展。生產者、消費者、監管機構對食品供應鏈潛在風險的警覺意識大大提高，據不完全估算，全球食品行業每年需耗費100億～150億美元應對這類食品欺詐。因此，希望在食品加工和生產中的上述風險都是可識別和可預防的。

利用PCR技術對食品中的成分進行基因檢測，陽性結果用測序技術加以驗證，這已經是一種非常成熟的技術。我國的很多國家標準和行業標準都采用了這種技術來應對食品摻假欺詐及對過敏成分進行檢測，如GB/T 20190-2006《飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應（PCR）法》、GB/T 23815-2009《豬肉制品中植物成分定性PCR檢測方法》、GB/T 23814-2009《蓮蓉制品中蕓豆成分定性PCR檢測方法》、SN/T 2978-2011《動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法》、SN/T 3730.4-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測 實時熒光PCR法》、SN/T 3730.5-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR法》、SN/T 3730.2-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第2部分：狗成分檢測 實時熒光PCR法》、SN/T 2867-2011《飼料中魚源性成分定性檢測方法PCR方法》、SN/T 3731.1-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第1部分：鵪鶉成分檢測 PCR法》、SN/T 3731.2-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第2部分：鵝成分檢測 PCR法》、SN/T 3731.3-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第3部分：鴿子成分檢測 實時熒光PCR法》等。

但是，PCR技術有個很大的缺陷，只能定性檢測，無法定量分析，無法分辨食品中含有的其他成分是惡意摻假還是由于共用生產線或生產器具等無法避免的原因造成的污染。

近年來，利用下一代測序技術（NGS測序技術），可以實現食品中各種動物源性成分的定量分析，而且這種技術已經投入商業應用中，一些大型檢測機構已經可以提供此項檢測服務。

2.2 特定物種分析

即便是同類原料，由于產地不同、品種不同，其價值會有巨大差異，但普通消費者又很難通過外觀、口感等加以區分，尤其當原料經過加工后，如水產品被去頭、去皮、去骨后，甚至再經煙熏、腌制等工藝。即便是專業人士，想要準確無誤地判斷產地、品種也非易事。

利用PCR技術，以16S rRNA基因的通用引物擴增魚類樣品的16S rRNA或其他特征基因片段，用測序技術分析其基因序列，再與權威發布的基因組數據庫進行比對，從而在基因層面上，確定原料的品種、產地信息。

運用這種技術制作物種鑒定的DNA條形碼，在技術層面上杜絕這類混淆品種的食品欺詐行為，是各國食品監管部門和檢測機構的手段之一。傳統的測序技術通常適用于初加工的水產制品，對于深加工的產品會有很多困難。下一代測序技術在深加工水產制品的種類鑒定上會發揮更多的作用。

2.3 食源性微生物的分析

食品工業的規模化進程、食品流通的廣泛性和快速性、農場生產模式的轉型、飲食習慣的變化，甚至國內和國際旅游人群的增加都是食源性疾病發病率升高、擴散速度加快的重要原因，食源性疾病已經成為全球公共衛生面臨的最嚴峻挑戰之一。在發達國家，每年患食源性疾病的人數高達30%；在美國，每年每6人中就有1人因為食用被污染的食品而生病，每年僅是沙門氏菌感染造成的直接醫療費用損失就達到3.65億美元，發展中國家的情況更加令人擔憂。據世界衛生組織（WHO）統計，全球每年5歲以下兒童的腹瀉病例達15億例次，造成約300萬個兒童死亡，其中，70%是由各種致病微生物污染的食品和飲水所致。據衛生部關于全國食品中毒事件情況的通報數據，僅2015年，全國微生物性食物中毒案例報告數為57起，占比33.73%；中毒人數3 181人，占比53.68%；死亡人數8人，占比6.61%，而這僅是實際發病人數的“冰山一角”。世界衛生組織估計發展中國家的漏報率高達95%以上。

食源性疾病作為食品安全的主要問題，世界衛生組織將其定義為“凡是通過攝食進入人體的，引發人體罹患感染性或中毒性的疾病”，其中包括由食品微生物污染和化學性物質引起的食源性疾病，微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要組成。因此，有必要加強對食源性致病菌在基因水平上的深入研究。要把預防和控制產業鏈中食源性致病菌污染作為重點，降低致病菌污染率。

利用測序技術可在信息缺乏或多種微生物存在的情況下對食源性致病微生物進行檢測判定，可在基因序列的背景下更科學地認識食源性致病菌的遺傳特性、代謝能力、致病機制等，為食源性微生物疾病預防和控制提供重要的依據。

例如，沙門氏菌（Salmonellae）是一種極為常見的食源性致病菌，在細菌性食物中毒都占有極高的比例，人類會通過多種途徑被感染。Ashton等[11]使用Illumina HiSeq2500測序技術對2013年爆發的沙門氏菌進行了全基因組的測序分析，證明了蛋黃醬中分離得到的鼠傷寒沙門氏桿菌DT 8（Salmonella typhimuriumDT 8）是導致人類感染的病原菌。

2011年5—7月，在德國由于大腸埃希菌（Escherichia coli O104:H4）污染生食蔬菜沙拉中的芽苗菜，導致了流行病的爆發。E. coliO104:H4是近年來新發現了一種血清型，其產生的志賀毒素導致腹瀉和溶血性尿毒綜合征。Rasko等[12]使用SMRT三代測序技術對大腸埃希菌（O104:H4）和7種來自非洲的腸致病型大腸埃希菌（O104:H4）以及4株屬于其他血清型的腸致病型大腸埃希菌（O104:H4）的參考菌株進行全基因組測序。結果顯示，導致德國疾病暴發的大腸埃希菌不同于其他的大腸埃希菌（O104:H4）菌株，屬于大腸桿菌屬系統發育樹下的另一個分支，因該菌株攜帶編碼的志賀毒素的前噬菌體和耐抗生素基因序列，所以對人體危害巨大。

3 應用前景

相對其他的食品檢測技術，測序技術在食品檢測和食品安全監管領域中起到的作用還在起步階段，仍需繼續努力，不斷完善。相信在不遠的未來，測序技術將更多地普及到各行各業，甚至成為未來實驗室分析以及食品安全檢測的常規檢測手段。