基因測(cè)序技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

◎ 王敏峰

（上海市酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心有限公司，上海 200081）

1 基因測(cè)序技術(shù)

在分子生物學(xué)研究中，DNA序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前，用于測(cè)序的主流技術(shù)有2類：①傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)，或稱為第一代測(cè)序技術(shù)，以雙脫氧鏈終止法（Sanger測(cè)序法）為代表。②近幾年發(fā)展起來的下一代測(cè)序技術(shù)（NGS測(cè)序技術(shù)），又被稱為高通量測(cè)序技術(shù)，其測(cè)序原理有邊合成邊測(cè)序、單分子測(cè)序和納米孔測(cè)序。具體來說，邊合成邊測(cè)序（也稱為第二代測(cè)序技術(shù)）以Roche公司的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa、Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為代表；單分子測(cè)序（也稱為第三代測(cè)序技術(shù)）以Helicos Bioscience公司的HeliScope遺傳分析系統(tǒng)和Pacific Biosciences公司的PacBio RS單分子實(shí)時(shí)測(cè)序系統(tǒng)為代表；納米孔測(cè)序（也稱為第四代測(cè)序技術(shù)），Oxfold Nanopore Technologies 公司的GridION和MinION等為代表[1]。

測(cè)試技術(shù)的飛速發(fā)展，使檢測(cè)通量有了革命性的改進(jìn)，同時(shí)大大降低了測(cè)序成本。此外，消費(fèi)者對(duì)于食品安全越來越重視，無論是生產(chǎn)者、消費(fèi)者還是監(jiān)管檢測(cè)機(jī)構(gòu)，都需要開發(fā)更精確、更高效的檢測(cè)方法，基因測(cè)序技術(shù)正迎合了這樣的需要，故而，基因測(cè)序技術(shù)與食品檢測(cè)領(lǐng)域的結(jié)合也應(yīng)運(yùn)而生。

2 基因測(cè)序技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 食品中成分的檢測(cè)

任何人為或者意外導(dǎo)致的食品摻假和污染都是不可接受的，但各種食品原料（如各種禽畜肉類、水產(chǎn)類）間巨大價(jià)差所帶來的豐厚利潤(rùn)，使得此類事件層出不窮，國內(nèi)國外都屢見不鮮。食品中摻入的其他未標(biāo)注成分也增加了食品過敏的風(fēng)險(xiǎn)，從國內(nèi)的“掛羊肉賣鴨肉”到歐洲的“馬肉風(fēng)波”，各種食品危機(jī)、食物過敏和食品欺詐的發(fā)生將摧毀消費(fèi)者對(duì)于食品安全的信心，也傷害了行業(yè)的健康發(fā)展。生產(chǎn)者、消費(fèi)者、監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)食品供應(yīng)鏈潛在風(fēng)險(xiǎn)的警覺意識(shí)大大提高，據(jù)不完全估算，全球食品行業(yè)每年需耗費(fèi)100億～150億美元應(yīng)對(duì)這類食品欺詐。因此，希望在食品加工和生產(chǎn)中的上述風(fēng)險(xiǎn)都是可識(shí)別和可預(yù)防的。

利用PCR技術(shù)對(duì)食品中的成分進(jìn)行基因檢測(cè)，陽性結(jié)果用測(cè)序技術(shù)加以驗(yàn)證，這已經(jīng)是一種非常成熟的技術(shù)。我國的很多國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)都采用了這種技術(shù)來應(yīng)對(duì)食品摻假欺詐及對(duì)過敏成分進(jìn)行檢測(cè)，如GB/T 20190-2006《飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè)定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》、GB/T 23815-2009《豬肉制品中植物成分定性PCR檢測(cè)方法》、GB/T 23814-2009《蓮蓉制品中蕓豆成分定性PCR檢測(cè)方法》、SN/T 2978-2011《動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法》、SN/T 3730.4-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》、SN/T 3730.5-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》、SN/T 3730.2-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第2部分：狗成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》、SN/T 2867-2011《飼料中魚源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法》、SN/T 3731.1-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第1部分：鵪鶉成分檢測(cè) PCR法》、SN/T 3731.2-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第2部分：鵝成分檢測(cè) PCR法》、SN/T 3731.3-2013《食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第3部分：鴿子成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》等。

但是，PCR技術(shù)有個(gè)很大的缺陷，只能定性檢測(cè)，無法定量分析，無法分辨食品中含有的其他成分是惡意摻假還是由于共用生產(chǎn)線或生產(chǎn)器具等無法避免的原因造成的污染。

近年來，利用下一代測(cè)序技術(shù)（NGS測(cè)序技術(shù)），可以實(shí)現(xiàn)食品中各種動(dòng)物源性成分的定量分析，而且這種技術(shù)已經(jīng)投入商業(yè)應(yīng)用中，一些大型檢測(cè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)可以提供此項(xiàng)檢測(cè)服務(wù)。

2.2 特定物種分析

即便是同類原料，由于產(chǎn)地不同、品種不同，其價(jià)值會(huì)有巨大差異，但普通消費(fèi)者又很難通過外觀、口感等加以區(qū)分，尤其當(dāng)原料經(jīng)過加工后，如水產(chǎn)品被去頭、去皮、去骨后，甚至再經(jīng)煙熏、腌制等工藝。即便是專業(yè)人士，想要準(zhǔn)確無誤地判斷產(chǎn)地、品種也非易事。

利用PCR技術(shù)，以16S rRNA基因的通用引物擴(kuò)增魚類樣品的16S rRNA或其他特征基因片段，用測(cè)序技術(shù)分析其基因序列，再與權(quán)威發(fā)布的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，從而在基因?qū)用嫔希_定原料的品種、產(chǎn)地信息。

運(yùn)用這種技術(shù)制作物種鑒定的DNA條形碼，在技術(shù)層面上杜絕這類混淆品種的食品欺詐行為，是各國食品監(jiān)管部門和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的手段之一。傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)通常適用于初加工的水產(chǎn)制品，對(duì)于深加工的產(chǎn)品會(huì)有很多困難。下一代測(cè)序技術(shù)在深加工水產(chǎn)制品的種類鑒定上會(huì)發(fā)揮更多的作用。

2.3 食源性微生物的分析

食品工業(yè)的規(guī)模化進(jìn)程、食品流通的廣泛性和快速性、農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)型、飲食習(xí)慣的變化，甚至國內(nèi)和國際旅游人群的增加都是食源性疾病發(fā)病率升高、擴(kuò)散速度加快的重要原因，食源性疾病已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。在發(fā)達(dá)國家，每年患食源性疾病的人數(shù)高達(dá)30%；在美國，每年每6人中就有1人因?yàn)槭秤帽晃廴镜氖称范。磕陜H是沙門氏菌感染造成的直接醫(yī)療費(fèi)用損失就達(dá)到3.65億美元，發(fā)展中國家的情況更加令人擔(dān)憂。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年5歲以下兒童的腹瀉病例達(dá)15億例次，造成約300萬個(gè)兒童死亡，其中，70%是由各種致病微生物污染的食品和飲水所致。據(jù)衛(wèi)生部關(guān)于全國食品中毒事件情況的通報(bào)數(shù)據(jù)，僅2015年，全國微生物性食物中毒案例報(bào)告數(shù)為57起，占比33.73%；中毒人數(shù)3 181人，占比53.68%；死亡人數(shù)8人，占比6.61%，而這僅是實(shí)際發(fā)病人數(shù)的“冰山一角”。世界衛(wèi)生組織估計(jì)發(fā)展中國家的漏報(bào)率高達(dá)95%以上。

食源性疾病作為食品安全的主要問題，世界衛(wèi)生組織將其定義為“凡是通過攝食進(jìn)入人體的，引發(fā)人體罹患感染性或中毒性的疾病”，其中包括由食品微生物污染和化學(xué)性物質(zhì)引起的食源性疾病，微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要組成。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)食源性致病菌在基因水平上的深入研究。要把預(yù)防和控制產(chǎn)業(yè)鏈中食源性致病菌污染作為重點(diǎn)，降低致病菌污染率。

利用測(cè)序技術(shù)可在信息缺乏或多種微生物存在的情況下對(duì)食源性致病微生物進(jìn)行檢測(cè)判定，可在基因序列的背景下更科學(xué)地認(rèn)識(shí)食源性致病菌的遺傳特性、代謝能力、致病機(jī)制等，為食源性微生物疾病預(yù)防和控制提供重要的依據(jù)。

例如，沙門氏菌（Salmonellae）是一種極為常見的食源性致病菌，在細(xì)菌性食物中毒都占有極高的比例，人類會(huì)通過多種途徑被感染。Ashton等[11]使用Illumina HiSeq2500測(cè)序技術(shù)對(duì)2013年爆發(fā)的沙門氏菌進(jìn)行了全基因組的測(cè)序分析，證明了蛋黃醬中分離得到的鼠傷寒沙門氏桿菌DT 8（Salmonella typhimuriumDT 8）是導(dǎo)致人類感染的病原菌。

2011年5—7月，在德國由于大腸埃希菌（Escherichia coli O104:H4）污染生食蔬菜沙拉中的芽苗菜，導(dǎo)致了流行病的爆發(fā)。E. coliO104:H4是近年來新發(fā)現(xiàn)了一種血清型，其產(chǎn)生的志賀毒素導(dǎo)致腹瀉和溶血性尿毒綜合征。Rasko等[12]使用SMRT三代測(cè)序技術(shù)對(duì)大腸埃希菌（O104:H4）和7種來自非洲的腸致病型大腸埃希菌（O104:H4）以及4株屬于其他血清型的腸致病型大腸埃希菌（O104:H4）的參考菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序。結(jié)果顯示，導(dǎo)致德國疾病暴發(fā)的大腸埃希菌不同于其他的大腸埃希菌（O104:H4）菌株，屬于大腸桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹下的另一個(gè)分支，因該菌株攜帶編碼的志賀毒素的前噬菌體和耐抗生素基因序列，所以對(duì)人體危害巨大。

3 應(yīng)用前景

相對(duì)其他的食品檢測(cè)技術(shù)，測(cè)序技術(shù)在食品檢測(cè)和食品安全監(jiān)管領(lǐng)域中起到的作用還在起步階段，仍需繼續(xù)努力，不斷完善。相信在不遠(yuǎn)的未來，測(cè)序技術(shù)將更多地普及到各行各業(yè)，甚至成為未來實(shí)驗(yàn)室分析以及食品安全檢測(cè)的常規(guī)檢測(cè)手段。