靶向抑制高表達HRR蛋白增強腫瘤細胞對放化療的敏感性

朱佳蓓，黃 楠，崔中奇，楊慶源，潘秋輝

（1.上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心檢驗科，上海 200127；2.同濟大學附屬上海第十人民醫院檢驗科，上海 200072）

DNA雙鏈損傷（double-stranded break，DSB）是最嚴重、最難修復的DNA損傷，是導致基因組不穩定和細胞死亡的主要原因[1]。同源重組修復（homologous recombination repair，HRR）通過精確修復DSB，維持正常細胞基因組的完整性和穩定性，是細胞發揮基本功能及維持生存的必要條件。正常細胞中HRR蛋白的缺失可導致基因組的嚴重不穩定，染色體突變增加，啟動細胞癌變[2]。放化療是臨床治療腫瘤的常用手段，其機制是通過射線、藥物誘導細胞發生DSB，激活凋亡途徑，致使腫瘤細胞死亡[3]。有研究證實，某些HRR蛋白在腫瘤細胞中高表達，高表達的HRR蛋白通過參與放化療導致的DSB修復，介導損傷耐受并抑制凋亡途徑，激活增殖信號通路，維持了腫瘤細胞基因組的完整性和穩定性，使腫瘤細胞對放化療耐受，得以繼續存活[4-5]。因此，這類高表達的HRR蛋白促進了腫瘤的形成與發展，它們有可能成為腫瘤精準治療的新靶點。為此，本文對腫瘤細胞中高表達的HRR蛋白如何促進腫瘤的發生、發展作一綜述。

1 HRR

HRR是指受損DNA以細胞內同源染色體相對應的序列作為模板，進行損傷修復的過程。此過程由Nijmegen斷裂綜合征1（Nijmegen breakage syndrome 1，NBS1）-減數分裂重組蛋白11同源物A（meiotic recombination 11 homolog A，MRE11）-DNA修復蛋白50（DNA repair protein RAD50，RAD50）（簡稱MRN）復合物、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）、重組蛋白A（recombination protein A，RecA），X射線修復交叉互補基因2（X-ray repair crosscomplementing gene 2，XRCC2）等一系列關鍵的HRR蛋白協同完成。

MRN復合物是HRR的核心效應分子，當DSB發生后，MRN復合物可以迅速感應損傷信號，定位于雙鏈損傷處，并將共濟失調毛細血管擴張癥突變激酶（ataxia-telangiectasia-mutated kinase，ATM）招募到損傷位點，ATM通過與MRN復合物相互作用發生自身磷酸化，形成磷酸化ATM（phosphorylated ATM，pATM）[6]。pATM可以將斷裂處的組蛋白H2AX磷酸化成γH2AX，將損傷信號放大，從而招募更多的修復蛋白如RAD51、BRCA1、BRCA2等到DSB損傷位點。MRN復合物和BRCA1共同參與受損DNA 5'-末端的切除，產生了3'-末端突出的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）[1]，復制蛋白A（replication protein A，RPA）隨后結合于ssDNA 3'-末端，RAD51在BRCA2、XRCC2等重組調節蛋白的作用下置換出RPA，并與ssDNA 3'-末端結合形成核蛋白纖維結構。同時RAD51可尋找、識別另一段與受損DNA同源的序列，并且刺激該ssDNA侵入同源DNA雙鏈進行配對和鏈交換，并在其他酶的作用下，完成DSB修復[2]。

2 腫瘤細胞中起癌基因功效的HRR蛋白

2.1 NBS1

NBS1基因位于人染色體8q21上，其編碼的蛋白N末端的叉頭相關結構域（forkhead- associated domain，FHA）與BRCA1 C末端結構域（carboxylterminal domain of BRCA1，BRCT）在HRR和激活G2/M期檢查點中發揮重要作用[7]，能夠維持正常細胞基因組的穩定性。NBS1通過其C末端區域與MRE11、RAD50形成MRN復合物，其中心區序列介導NBS1被ATM特異性磷酸化，從而傳遞損傷信號[1]。NBS1缺失使得RAD50、MRE11無法定位于損傷位點，正常細胞內發生的DSB難以修復，大大提高細胞癌變的概率，因而NBS1以往被認為是一種抑癌基因。

然而，有研究結果顯示，NBS1在非小細胞肺癌、食管癌等不同類型的腫瘤中呈高表達。高表達的NBS1通過參與HRR維持了肺癌細胞基因組的穩定性，并通過提高生長因子受體下游分子磷脂酰肌醇激酶的活性，導致蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）磷酸化水平升高，從而促進肺癌細胞增殖、腫瘤的形成與侵襲[8]。此外，在人頭頸部鱗狀細胞癌的裸鼠模型中轉基因表達突變NBS1，發現其通過下調NBS1表達干擾MRN復合物的修復功能，從而增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性，使腫瘤體積明顯縮小[9]。另外，MRN復合物抑制劑OBP-301能夠增強腫瘤細胞對放療的敏感性[10]。

2.2 MRE11

MRE11是MRN復合物的重要組分，具有3'~5' DNA雙鏈外切酶活性、單鏈DNA內切酶活性，其通過激活核酸外切酶1（exonuclease 1，EXO1）的5'~3' DNA雙鏈外切酶活性，參與受損DNA 5'-末端的剪切，促進HRR過程[11]。

有研究結果顯示，MRE11的蛋白水平與乳腺癌惡性程度、復發與轉移呈正相關，高表達MRE11的乳腺癌細胞通過提高信號傳導、轉錄激活因子3（signal-transducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化水平和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）水平，促使該類細胞增殖、遷徙和侵襲；同時這類細胞也具有較強的修復放療引起的DSB活力，使其在放療后得以存活，這是乳腺癌復發率增加、患者生存率下降的主要原因之一[12]。此外，動物實驗證實MRE11突變增強了抗腫瘤藥物胸苷和喜樹堿對結腸癌的抑制作用[13]。有研究結果顯示，MRE11的靶向抑制劑——腺病毒蛋白E4orf3和E4orf6可通過阻礙DSB修復，增強放療對腫瘤細胞的殺傷作用[14]。

2.3 BRCA1

BRCA1基因位于人染色體17q21，其突變提高了患乳腺癌和卵巢癌的風險，因而BRCA1過去被認為是一種抑癌基因[15]。BRCA1蛋白通過N末端環結構域與BRCA1相關環狀蛋白（BRCA1-associated RING domain protein，BARD1）組成的異二聚體可以抑制腫瘤的形成[16]。BRCA1 C末端BRCT結構介導了其與受體相關蛋白80（receptorassociated protein 80，RAP80）的間接結合[16]。當DNA損傷發生后，RAP80通過參與泛素依賴的信號途徑，將BRCA1招募到DNA損傷位點，共同參與HRR并激活G2/M周期檢查點，以維持正常細胞基因組的穩定性，從而阻止細胞癌變[17]。

然而，有研究結果顯示，BRCA1在膠質母細胞瘤中呈高表達，高表達的BRCA1通過調控核糖核苷酸還原酶催化亞基的轉錄水平，保護其DNA不受內源性復制壓力的損傷，抑制凋亡途徑，促進腫瘤的發生與發展；而穩定敲除腫瘤細胞中的BRCA1可以抑制抗腫瘤藥物羥基脲引發的復制叉停滯的恢復，從而促進其凋亡[18]。此外，在胰腺癌動物模型中發現BRCA1突變能夠抑制HRR，從而加劇吉西他濱和順鉑導致的DSB積聚，因此靶向胰腺癌細胞中的BRCA1能夠增加該細胞對化療藥物的敏感性[19]。BRCA1的抑制劑——細胞透性蛋白-蛋白相互作用抑制劑能夠有效提高宮頸癌細胞對放療的敏感性[20]。

2.4 RAP80

RAP80基因位于人染色體5q35上，其編碼蛋白的氨基端含有2個泛素相互作用模體（ubiquitin-interacting motif，UIM）。RAP80蛋白可以通過UIM基序特定識別賴氨酸第63位殘基K被泛素修飾過的γH2AX，使DNA損傷信號放大[21]。UIM結構域也介導了BRCA1、RAP80、卷曲螺旋結構域蛋白98（coiled-coil domaincontaining protein 98，CCDC98）、乳腺癌易感復合物亞基36（BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 36，BRCC36）等修復蛋白復合物的形成[16]，促使RAP80招募多種修復蛋白到DNA損傷位點，參與HRR過程，從而維持細胞基因組的穩定性與復制的精準性，進而抑制細胞惡變。

但有研究結果顯示，在宮頸癌細胞中過表達RAP80可以提高雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ERα）蛋白水平，促進腫瘤的發生、發展[22]。此外，還有研究結果顯示RAP80在胰腺癌中呈高表達，高表達RAP80的胰腺癌細胞具有較強的修復活力，能夠修復化療藥物引起的DSB，導致其對化療藥物吉西他濱的敏感性下降，而RAP80缺失的胰腺癌細胞通過調控死亡受體途徑中BCL-2相關X蛋白（BCL2-associated X，BAX）以及B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）的表達，促進胰腺癌細胞凋亡[3]。

2.5 RAD51

RAD51是大腸埃希菌重組酶A（recombinase A，RecA）的真核細胞同源物，具有啟動DNA同源序列的查找、配對及鏈交換的功能，是HRR不可或缺的組分[23]。

有研究結果顯示，RAD51蛋白在三陰性乳腺癌中呈高表達，體內、體外實驗均證實高表達的RAD51通過促進HRR，降低了腫瘤干細胞對聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]抑制劑奧拉帕尼的敏感性，從而導致腫瘤的轉移和復發；穩定敲除乳腺癌細胞中的RAD51后，能夠有效地減弱該類細胞抵抗PARP1抑制劑的能力，進而激活凋亡途徑，使腫瘤生長受到明顯抑制[24]。此外，有臨床研究證實RAD51的小分子抑制劑B02通過阻礙HRR增強了多發性骨髓瘤細胞對抗腫瘤藥物阿霉素的敏感性[25]。

2.6 XRCC2

XRCC2基因位于人染色體7q36.1上，其編碼的蛋白是RecA RAD51亞家族的成員之一。XRCC2通過與RAD51C、RAD51D等RAD51類似物形成復合物，聚集于復制叉及Holliday連接體，促進RAD51介導的同源序列配對及鏈交換，是HRR通路中的核心成分[26-27]，因而能夠有效地減少染色體突變，從而阻止細胞惡性轉化。

然而，有研究結果顯示XRCC2蛋白在直腸癌中高表達，高表達XRCC2的腫瘤細胞可以修復電離輻射引起的損傷，使腫瘤細胞在放療后存活，促進直腸癌發展[28]。此外，有研究結果顯示，穩定敲除XRCC2后，停滯在G2/M期的結腸癌細胞增多，同時凋亡途徑被激活，使得該類細胞對射線更敏感，從而抑制結腸癌的生長[29]。因此，XRCC2或許可成為解決腫瘤細胞放療耐受性的潛在靶點。

2.7 微囊蛋白1（caveolin-1，Cav-1）

Cav-1基因位于人染色體7q31.1上， 其編碼的蛋白是細胞膜穴樣內陷中的主要結構蛋白，參與了HRR通路。當DSB發生后，Cav-1通過抑制蛋白磷酸酶2的活性，激活由ATM磷酸化開始的修復途徑，同時促使BRCA1在損傷位點的進一步聚集[30]，在維持細胞基因組的完整性中發揮重要作用。

然而，有研究結果顯示，在Cav-1高表達的胰腺癌中，Cav-1促進了胰腺癌細胞的增殖、侵襲與遷徙。通過RNA干擾技術敲除胰腺癌細胞中的Cav-1后，Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）-STAT3細胞生存信號通路受阻，隨即通過活化內源性凋亡途徑，使細胞增殖活力減弱、凋亡增加[31]。此外，胰腺癌細胞中Cav-1的表達在經過放療后發生轉錄依賴性的上調，進而保護細胞抵抗基因毒性應激[32]，因此人工誘導Cav-1缺陷能有效增加腫瘤細胞對放療的敏感性。

3 腫瘤干細胞中的HRR蛋白

腫瘤干細胞是腫瘤組織中極少數具有干細胞特性，即自我更新、無限增殖、多分化潛能的細胞群[33]。有研究結果顯示，在多種腫瘤中，呈現干細胞特征的腫瘤細胞群HRR活性增強，是導致其抵抗放化療、腫瘤復發和轉移的重要原因[34]。大腸癌細胞中高表達的NBS1、RAD51D以及乳腺癌細胞中高表達的RAD51均介導了腫瘤干細胞對放化療的耐受性[24，26]。因此，通過抑制HRR蛋白可以有效地阻斷腫瘤干細胞的損傷后修復，進一步提高腫瘤患者的放化療療效。

4 總結和展望

HRR有助于維持正常細胞基因組的穩定性與復制的精準性，從而抑制腫瘤的發生。現有的研究結果揭示某些HRR蛋白在腫瘤細胞中表達顯著增加，這類HRR蛋白在維持腫瘤細胞基因組穩定性中同樣具有重要作用。它們通過參與放化療誘導DSB的修復耐受損傷，或抑制凋亡，或激活增殖相關信號通路，起到了癌基因的作用，使腫瘤細胞繼續存活，促進了腫瘤的發生、發展。腫瘤細胞對放化療耐受是腫瘤治療失敗、復發與轉移的主要原因，而腫瘤干細胞中高表達的這些HRR蛋白具有極強的HRR活力，提高了其抵抗放化療的能力。這類在腫瘤細胞中高表達的HRR蛋白為腫瘤的精準個性化治療、解決放化療耐受問題帶來了新思路，通過藥物抑制HRR蛋白的表達，使腫瘤細胞在經過放化療后DNA發生不可修復的破壞，繼而激活凋亡機制，有效地增加腫瘤細胞對放化療的敏感性，從而使腫瘤細胞死亡。因此，更為透徹地了解HRR蛋白在腫瘤細胞中的作用對指導臨床用藥、改善腫瘤的預后等均具有重要意義。