高效液相色譜-串聯質譜測定熟肉制品中氯霉素藥物殘留

◎ 肖植國，梅 群，孔維芬，張 馨

（曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000）

氯霉素類藥物具有廣譜抗菌能力，在水產養殖和畜牧養殖中都廣泛應用。這些藥物基本性質一般都比較穩定，而且不容易降解，尤其在水產品中的殘留物可以通過食物鏈循環進入人體，激素類，主要有氯霉素和甲砜霉素還有氟苯尼考等組成。氯霉素具有很強毒副作用，可抑制人體骨髓造血功能，不斷影響人類的再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏癥等[1-3]。是白色或無色的針狀或片狀結晶，熔點149.7～150.79 ℃，易溶于甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，微溶于乙醚及氯仿，不溶于石油醚及苯。氯霉素極穩定，其水溶液經5 h煮沸也不失效。

氯霉素分子中含有對位硝基苯基基團、丙二醇和二氯乙酰胺基。由于氯霉素分子中有2個不對稱碳原子，所以氯霉素有4個光學異構體，其中只有左旋異構體具有抗菌能力。氯霉素類藥物殘留檢測方法主要有微生物法、酶聯免疫法、氣相色譜法、液相色譜法、超高效液相色譜法、液相色譜-質譜法和超高效液相色譜-串聯質譜法等[4-6]。

其中超高效液相色譜-超高效液相色譜借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，具有分析速度快、選擇性強 、靈敏度高等優點，是氯霉素類藥物分析首選的方法。處理一般采用乙酸乙酯或乙腈反復多次提取、正己烷萃取、濃縮溶解，過固相萃取柱（SPE）凈化，再氮吹濃縮，定容測定。

原料熟肉出現問題，需要快速準確可靠的檢測方法進行佐證。對熟肉制品中氯霉素和中氯霉素類藥物殘留的檢測具有很重要的意義。較好的樣品前處理方法具有有機試劑消耗量少、測定周期短、選擇性好、靈敏度高和定性定量準確等特點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津30A超高效液相色譜儀（日本島津），島津8040質譜儀（日本島津），Mettler TLEDO205DU電子天平，PURELAB F1一體式超純水儀（英國ELGA公司），TGL-10B型離心機（上海安亭科學儀器廠），10～1000 μL移液器（Transferpette德國），ZH-2DLENDER型渦旋振蕩器（杭州高德泰林）。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

選擇SHIMADZUShimpack FCODS柱（85 mm×4.6 mm，3 μm）為分析柱，甲醇（A）和0.1%甲酸（B）作流動相，流速0.2 mL/min，柱溫40.0 ℃。采用梯度洗 脫：0～ 2 min，20% ～ 95% A；2.0～ 2.01 min，95%～20%A；2.01～11.0 min，20% A。色譜柱：島津Shim-Pack FC-ODS75 mm×4.6 mm；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：甲醇+水，洗脫液。

1.2.2 質譜條件

采用多反應監測（MRM）模式，使用TIS（+）源分析。多反應監測（MRM），離子源溫度（TEM）550 ℃；輔助氣流速（GS2）：70 psi；發現樣品測試結果和加標回收率無差別，標準溶液溶劑的選取分別比較了甲醇、超純水、0.1%甲酸。使用甲醇作溶劑時，定量離子對、碰撞氣能量（CE）及碰撞室出口電壓（CXP）、碰撞室入口電壓（EP）和去簇電壓（DP）。使用超純水和甲酸水溶液作溶劑時3種峰的峰型對稱且尖銳，同時考慮到與實際水樣分析時的一致性，故選擇超純水作溶劑。同內徑（0.22 μm）的水相濾頭進行實際水樣、濾頭不同品牌材質（PES）、加標水樣的比較，3種化合物的峰型毛刺很多，甚至出現雙頭峰。

1.3 樣品前處理

1.3.1 液體熟肉

用1000 mL棕色玻璃瓶采集滿瓶水樣，不留頂空，采集后儲存在4 ℃暗處，當天分析。地表水及飲用水源地等干凈水樣可直接進樣，廢水或較臟的水樣可過0.22 μm水相濾頭后再進樣。準確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入50μL氘代氯霉素內標100 μg/L的工作溶液，加入10 mL乙腈和1 g氯化鈉，以8000 r/min離心10 min，上清液轉移至另一個20 mL試管中，合并乙腈提取液于50 ℃水浴氮氣吹至約3 mL，加入乙腈飽和正己烷約3 mL渦旋混合萃取3次，氣吹至近干，20%（v∶v）甲醇水定容至1.0 mL，過0.22 μm水相濾膜后上機測定。

1.3.2 熟肉粉

試樣于50 mL離心管中，準確稱取2 g，在加入50 μL氯霉素-D5，準確稱取100 μg/L溶液，加入15 mL水振蕩至奶粉完全溶解，以后步驟與之前的相同。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

在肉制品加工中，常加入一定量的天然物質或化學物質，這對肉制品加工的質量提高有一定的作用，而且正確使用輔料，也對提高肉制品的質量和產量有著很重要的作用，尤其要增加肉制品的花色品種，提高商品價值和營養價值，都具有十分重要的意義。熟肉粉的前處理，先采用16 mL純凈水充分溶解奶粉中沉淀物質，超聲15 min，再加入乙腈提取，這種分解式的提取方法效果更好。節約了成本，節約處理時間。這種方法與國家標準相比較，樣品前處理基質干擾較小，縮短了分析周期，節省了大量濃縮和固相萃取凈化的時間[7]。

2.2 不同條件下色譜條件的選擇

國家標準：采用甲醇水（60∶60=V∶V）∶乙腈水（60∶60=V∶V）比例同等梯度洗脫。或者選擇SHIMADZU Shimpack FCODS柱（75 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）和0.3%甲酸（B）作流動相，流速0.2 mL/min，柱溫40.0 ℃。采用梯度洗脫：0～5 min，30% ～ 95%A；4.0～ 2.01 min，95% ～ 20%A；4.01～11.0 min，20%A。在不同的環境下實際測量定樣品時，分流進樣，降低樣品進入色譜柱的量。原料的濃度不同時，一般可以用分流。微量組分一般不用分流，分流比太小或進樣量太大，目標物與干擾不同雜質的液體流出，在不同的環境下會對目標物的離子化產生嚴重的抑制作用。采用甲醇溶液梯度洗脫，目標物得到很好的分離，不同色譜條件選擇的同時檢測中雜質對目標物質離子化具有抑制作用。

3 結語

樣品凈化的之前的步驟處理優化很關鍵，乙腈使用量減少，避免了凈化柱的污染。這不但意味著此次試驗具有簡單、快速、靈敏度高、準確性強等特點。同時也降低了時間成本，還可以減少了實驗過程中有機試劑對身體的危害。這種方法同時也可以適用于熟肉制品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的測定。