大腸桿菌毒力因子及耐藥機制研究進展

赫鳴睿

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱為大腸桿菌，是德國科學家Theodor Escherich于1885年發現，在相當長的時間內，被認為是腸道內微生物的正常組成部分，而且是不引起致病作用的[1]。直到20世紀中期，科學家才發現有一部分血清型比較特殊的大腸桿菌可以對人和動物產生致病性，這類大腸桿菌常引起幼齡動物發生嚴重腹瀉和敗血癥等疾病。現在根據不同的生物學特性將致病性大腸桿菌主要分成6類：腸致病性大腸桿菌(EPEC)、產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)和彌散黏附性大腸桿菌(DAEC)。這些可致病的大腸桿菌能夠在不引起動物發病的情況下，長期生活在健康動物的腸道內，并且這類具有致病性的大腸桿菌還能在不同種動物之間進行傳播，給我國的畜牧業發展帶來巨大威脅[2]。

1 大腸桿菌毒力因子研究進展

1.1 黏附素

大腸桿菌侵入動物體內后，首先要保證菌體在宿主體內定植，這樣才可以有利于細菌的生長繁殖，大腸桿菌的黏附作用是作為其腸道內生存的必備定植條件。因此稱這種起到黏附作用的菌體成分為定植因子也叫作黏附素。黏附素是分布在菌體表面的一種結構成分，這些表面結構復雜，種類眾多，不同的黏附素對腸表面細胞黏附作用程度也不同。大腸桿菌利用其特殊的黏附素緊密附著在在腸上皮細胞表面，以免受到腸蠕動而脫落。根據黏附素的形態結構差異一般分為菌毛黏附素和非菌毛黏附素兩種。菌毛黏附素包括I型菌毛黏附素、P菌毛黏附素和卷曲菌毛黏附素；非菌毛黏附素包括菌體表面蛋白、血凝素、纖毛樣物質等。由于每種菌毛黏附素只能黏附于具有相應受體的細胞表面，所以細菌的黏附具有細胞特異性和宿主特異性。例如，含F4菌毛的大腸桿菌只定植于宿主的小腸前段，含F5菌毛的大腸桿菌則可以定植于空腸、回腸段。

1.2 腸毒素

大腸桿菌腸毒素是一種細菌外毒素，是由產腸毒素性大腸桿菌生長繁殖過程中在菌體內產生的，并且可以釋放到菌體外。根據腸毒素對高溫條件的不同耐受程度分為兩類，一類為耐熱型腸毒素(ST)，另一類為不耐熱腸毒素(LT)。ST是由18～19個氨基酸形成的一種多肽小分子， ST是細菌外毒素，具有和其他細菌外毒素一樣的活性，可以對動物腸道產生毒性，由于ST分子量小且基本沒有免疫原性，所以對ST的研究程度較低。LT是由一個A亞單位和5個B亞單位組合構成的大分子。與ST不同，LT具有良好的免疫原性，因此LT在預防動物疾病方面受到廣泛研究。

1.2.1 耐熱腸毒素(ST)

ST在100 ℃加熱30 min都不會失活。ST蛋白的分子量約在2 Kda左右，一個ST分子具有3個分子內二硫鍵，二硫鍵是保證ST分子結構穩定的重要因素，原因是二硫鍵有較高的鍵能。ST不僅耐熱，還耐強酸強堿和多種有機溶劑。研究表明通過特殊方法處理可以使ST表現出免疫原性。J.C.Frantz報道稱，將ST與載體蛋白相連，再加入弗氏佐劑后，作為疫苗對動物進行免疫可使動物產生高水平的抗ST抗體，這對易感動物抵抗ETEC感染具有良好的效果。

1.2.2 不耐熱腸毒素(LT)

LT在65℃溫度下加熱30min就能夠完全滅活，LT具有很好地免疫原性，是由于LT中的B亞單位這一特殊結構，不僅LT具有免疫原性，單獨的B亞單位自身也具有良好的免疫原性。這使得LT在作為黏膜免疫原，以及黏膜免疫佐劑這兩項研究方面得到極大重視。研究發現可以把無毒LT或者單獨B亞單位作為黏膜免疫原，也可以將LT作為黏膜免疫佐劑，與其他免疫蛋白一同進行免疫，都能夠有效刺激動物機體產生免疫反應。

1.3 HPI毒力島

HPI又稱強毒力島，在大腸桿菌致病過程中發揮很大的作用，HPI首次發現于耶爾森菌屬，之后在其他腸道致病菌的染色體中也檢測出HPI毒力島。在HPI毒力島中，有一個被稱作irp2-fyuA的基因簇，它是由irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-fyuA這5段基因聯合組成的，被認為是HPI的核心功能區，其中irp2基因與鐵調節蛋白有很大關系。irp2和fyuA是HPI中非常重要的兩個功能基因，用于檢測大腸桿菌基因組中是否存在HPI毒力島的標志基因。

1.4 LEE毒力島

LEE稱為致病性腸細胞脫落位點毒力島，它發現于腸致病性大腸桿菌(EPEC)的染色體中，EPEC在入侵機體后，首先會黏附在宿主細胞表面部位，之后對宿主組織造成嚴重病理損傷，這種損傷叫作黏附與脫落(A/E)。eaeA和ler是LEE毒力島中最重要的兩個功能基因。在所有能夠導致A/E損傷的大腸桿菌全基因組中，都能檢測到eaeA基因。

2 大腸桿菌耐藥機制

有研究顯示，大腸桿菌極非常容易產生耐藥性，而且各類耐藥菌株其耐藥譜廣泛，菌株變異速度增加，導致現在臨床常用的抗生素治療效果不佳甚至無效。常清利等報道[3]，對河南部分地區分離得到的215株大腸桿菌進行耐藥基因檢測，其中，對氨芐西林的耐藥率最高，可以達到84.8%，對慶大霉素、阿莫西林、頭孢呋辛等也高達70%左右的耐藥率。方雨玲等報道[4]，對湖北地區231株大腸桿菌臨床分離株進行藥敏試驗，其中，大腸桿菌對強力霉素、氨芐青霉素、卡那霉素等藥物具有較高耐藥性，對四環素類藥物已經完全耐藥。目前多重耐藥株十分普遍，這使得臨床使用抗生素治療大腸桿菌病的困難加大，細菌性疾病嚴重影響畜禽的生產性能，所以必須要加強畜牧業生產中對抗生素使用的管制措施。

2.1 大腸桿菌對磺胺類藥物的耐藥機制

葉酸對蛋白質、核酸的合成及各種氨基酸的代謝具有重要作用，缺乏葉酸可使細菌由于代謝功能紊亂而造成死亡。磺胺類藥物結構與對氨基苯甲酸結構相似，當前者濃度在菌體內遠大于后者時，可在二氫葉酸合成中取代對氨基苯甲酸的位置而阻斷二氫葉酸的合成，這導致大腸桿菌的葉酸合成受阻造成細菌死亡。之所以革蘭氏陰性菌能夠產生耐藥性，主要與sul 1、sul 2和sul 3這三種耐藥基因有關，這三種耐藥基因的主要作用就是編碼二氫葉酸合成酶的蛋白結構，使其能夠不受磺胺類藥物的干擾與正常的對氨基苯甲酸結合，產生二氫葉酸，從而介導細菌產生耐藥性[5-6]。研究顯示，sul族類基因能夠定位在Tn21家族的轉座子中，同時與其他一些耐藥基因連接導致耐藥性[7]。

2.2 大腸桿菌對β-內酰胺類藥物的耐藥機制

大腸桿菌對β-內酰胺類藥物耐藥機制主要有兩種方式，一是主動外排泵，二是產生β-內酰胺水解酶，其中最主要的機制是產生β-內酰胺水解酶。這種酶能夠水解β-內酰胺類抗生素，破壞抗生素的分子結構，使其不能發揮作用。

2.3 大腸桿菌對氨基糖苷類藥物的耐藥機制

大腸桿菌對氨基糖苷類藥物有三種耐藥機制，一是改變細胞壁的通透性，這使得少量藥物能進入菌體，無法達到足夠殺滅病原體的藥量，導致細菌出現耐藥；二是改變作用靶位點，氨基糖苷類藥物的結合位點在細菌30S核糖體亞單位的16S rRNA解碼區的A部位，影響細菌蛋白質的合成，大腸桿菌能夠使16S rRNA發生甲基化，從而改變解碼區A部位的結構和位置，使得氨基糖苷類藥物不能結合作用位點而失去效果；三是氨基糖苷類鈍化酶的產生[8-9]，產生鈍化酶是細菌最主要的耐藥機制，細菌可以產生3種鈍化酶，分別是氨基糖苷磷酸轉移酶；氨基糖苷核苷轉移酶；氨基糖苷乙酞轉移酶，經過鈍化酶對抗生素的修飾和水解作用破壞氨基糖苷類藥物活性[9]。

2.4 大腸桿菌對四環素類藥物的耐藥機制

大腸桿菌對四環素類藥物的耐藥機制為主動外排作用。大腸桿菌基因組中含有tet外排泵基因，它能夠編碼一種大小為46 ku的膜結合外排泵蛋白，該蛋白是外排系統的主要功能蛋白，外排系統將擴散進細菌中的抗菌藥物泵出菌體外，導致大腸桿菌產生耐藥性。

2.5 大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制

喹諾酮類藥物作用于細菌的DNA旋轉酶和拓撲異構酶，進而阻斷細菌DNA復制，引起細菌死亡。大腸桿菌基因突變導致DNA旋轉酶和拓撲異構酶的結構和功能也發生改變，還會改變藥物作用的靶位點，使喹諾酮類藥物不能結合DNA旋轉酶和拓撲異構酶，就不會對細菌生長起到抑制作用。

3 小結

預防家畜發生大腸桿菌病，首先要加強環境的管理工作，及時清理畜舍糞便、做好消毒工作、保持通風、維持舍內溫度，確保飼養舍干燥與清潔。現在已開發出眾多可用于治療家畜大腸桿菌病的商品抗體。其中，商品化雞卵黃抗體因其化學性質穩定、特異性強、易規模化生產等特點充分凸顯其應用價值而備受養殖戶歡迎，研究表明雞卵黃抗體對于家畜大腸桿菌病有很高的治愈率。大腸桿菌自家滅活疫苗用于預防本場常年流行的大腸桿菌病效果顯著，因為這是用本場中引起發病的大腸桿菌株制備的滅活疫苗，具有安全性高、價格低廉等優點，而且制苗菌株的抗原性和發病菌株的抗原性高度一致，可以發揮良好的保護作用。養殖戶必須及時做好疫苗免疫工作，一方面做好流動人員的防護和消毒工作，防止外源性致病菌的侵入，另一方面要經常觀察家畜狀態，提供家畜新鮮的水源和飼料，保持家畜的機體健康，不要給內源性病原大量繁殖提供便利，全面做到以上工作才能降低養殖場中大腸桿菌病的發病率，為養殖場創造更大的經濟效益。