寨卡病毒診斷研究進(jìn)展與展望

尹景峰

（臨沂市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，山東 臨沂 276000）

寨卡病毒病是由寨卡病毒（Zika viurs,ZIKV）引起的，以發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛或結(jié)膜炎為主要臨床癥狀的急性傳染病，主要通過(guò)蚊媒傳播，極少引起死亡，但孕婦感染后可能會(huì)導(dǎo)致胎兒小腦畸形甚至死亡[1-3]。2015年5月在巴西暴發(fā)大規(guī)模疫情，呈現(xiàn)蔓延擴(kuò)大和跨境傳播趨勢(shì)。據(jù)世衛(wèi)組織估計(jì)，巴西約有150萬(wàn)人感染了寨卡。在2015年10月至2016年1月期間，有超過(guò)3500例嬰兒畸形的病例。2016年2月世衛(wèi)組織稱，這種病毒很可能在大部分美洲國(guó)家暴發(fā)，且已被WHO列為全球緊急公共衛(wèi)生事件。因此，開(kāi)展針對(duì)寨卡病毒的診斷快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)疾病的初期篩選、疫情防控有重要作用[4-6]。

1 當(dāng)前診斷方法

1.1 分子診斷方法

分子檢測(cè)方法包括兩步：（1）細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒的檢測(cè)；（2）利用PCR或熒光定量PCR （Real-time PCR，RT-PCR）進(jìn)行基因組的檢測(cè)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過(guò)細(xì)胞病變確定病毒的存在，再利用TCID50確定陽(yáng)性結(jié)果[7]。近幾年來(lái)，RT-PCR發(fā)展快速，可特異、敏感、快速、可重復(fù)的檢測(cè)較低含量的病毒[8]。這些方法的建立，均需要引物和探針的高特異，同時(shí)還需高敏感、定量的可靠性。

Calvet[9]通過(guò)病毒宏基因組學(xué)和基因序列分析，建立了針對(duì)孕婦檢測(cè)ZIKV的RT-PCR方法，其可在羊水中檢測(cè)病毒，但不能在尿液和血清樣品中進(jìn)行病毒的檢測(cè)。Musso[7]使用NucliSENSR?easyMAGR?System（BioMérieux公司）對(duì)唾液樣本進(jìn)行了RNA提取，再使用兩套引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果在748份血液樣品中檢測(cè)到210份陽(yáng)性（28.1%），在319份唾液樣本中檢測(cè)到182份陽(yáng)性（57.1%），表明在唾液樣本中檢測(cè)到ZIKV RNA的比例比血液樣本中高。由于ZIKV與DENV和CHIKV有相似的臨床癥狀，因此有研發(fā)人員[1,3]已建立了一種可檢測(cè)ZIKV的一步熒光定量PCR方法，檢測(cè)最低線為140個(gè)病毒拷貝，在88份有疑似DENV臨床癥狀的病人血漿樣本中，成功檢測(cè)出ZIKV。Waggoner[4]建立了多重RTPCR方法，可同時(shí)檢測(cè)ZIKV，改善的方法檢測(cè)靈敏度與常規(guī)RT-PCR相當(dāng)，并可檢出31份ZIKV陽(yáng)性。這些結(jié)果均表明，在當(dāng)前缺乏合適的替換檢測(cè)方法的前提下，對(duì)有低病毒血癥的臨床樣本（例如血漿）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，提高檢測(cè)方法的敏感性是很重要的[2,5]。

盡管PCR為基礎(chǔ)的分子手段可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒的檢測(cè)，但仍有諸多局限，例如漏檢、假陰性、需要合適的質(zhì)量控制措施、需要將DENV/ZIKV基因組RNA轉(zhuǎn)為DNA。針對(duì)這些局限，已有相應(yīng)對(duì)策，例如樣品稀釋、使用小體積、反應(yīng)體系中加入化學(xué)試劑（例如吐溫）[2-3]。

1.2 免疫測(cè)定方法

當(dāng)前ZIKV疫情的暴發(fā)，對(duì)孕婦有極大的威脅。由于孕期個(gè)體與非孕期個(gè)體的抗體反應(yīng)不同，因此對(duì)孕婦進(jìn)行ZIKV免疫應(yīng)答檢測(cè)時(shí)，需要格外重視。黃病毒感染后數(shù)天機(jī)體即可產(chǎn)生IgM抗體，且可持續(xù)3個(gè)月[6]；IgM抗體產(chǎn)生后數(shù)天即可產(chǎn)生IgG抗體，并可持續(xù)數(shù)月。此方法已被FDA批準(zhǔn)，且在2016年2月26日，被CDC推薦用于人血清和腦脊液中病毒的檢測(cè)[2,7]。根據(jù)CDC出具的臨床癥狀和流行病學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)疑似人群已經(jīng)使用ZIKV MAC-ELISA進(jìn)行篩查[8]。雅浦島的寨卡疫情的暴發(fā)，僅記錄了少數(shù)感染者 （n=11）的免疫反應(yīng)情況[9]。當(dāng)使用Zika MAC-ELISA和捕獲IgG的ELISA（使用滅活的全病毒和單克隆抗體）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)IgM可在癥狀出現(xiàn)后3天即可檢測(cè)到，而IgG是在一個(gè)無(wú)黃病毒感染史的寨卡病人出現(xiàn)癥狀后10天檢測(cè)到[3]。隨后試驗(yàn)也可在出現(xiàn)發(fā)燒癥狀的第5天檢測(cè)到特異性中和抗體。Euroimmun公司[2]研制了第一個(gè)完整的試劑盒，可利用ELISAs和間接免疫熒光法檢測(cè)針對(duì)病人血液中多種病毒的特異性抗體（IgM、IgG）。

將單克隆抗體應(yīng)用于檢測(cè)技術(shù)中有很大優(yōu)勢(shì)，由于其對(duì)抗原特異性位點(diǎn)的結(jié)合能力，因此會(huì)有強(qiáng)特異性，會(huì)降低交叉反應(yīng)。Adungo[3,5]建立了針對(duì)黃病毒的單克隆抗體，將Mabs應(yīng)用于檢測(cè)抗原或IgM的ELISA中，為建立和改善針對(duì)ZIKV的檢測(cè)試劑盒做準(zhǔn)備。但有其他黃病毒感染史的病人進(jìn)行ELISA方法時(shí)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 紙盤(pán)結(jié)合支點(diǎn)開(kāi)關(guān)技術(shù)

由于Zika病毒的全球傳播和小頭畸形的比例增加，建立特異、敏感的及時(shí)檢測(cè)方法，已成為公共衛(wèi)生事件急需解決的事情[6]。研究人員利用合成生物學(xué)，將支點(diǎn)開(kāi)關(guān)技術(shù)[7]、可視化紙盤(pán)檢測(cè)技術(shù)[8]融合在一起，建立了可對(duì)ZIKV快速、低廉、便攜、特異的檢測(cè)方法[9]。首先，根據(jù)病毒RNA人工設(shè)計(jì)支點(diǎn)開(kāi)關(guān)中的switch RNA序列，5`端有可與病毒RNA靶區(qū)域結(jié)合的序列，隨后是發(fā)卡結(jié)構(gòu)，包含有強(qiáng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribose-binding site，RBS）和起始密碼子，接著跟隨可編碼報(bào)告基因的序列。接著，又利用了可視化紙盤(pán)檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)?？梢暬埍P(pán)是將無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、支點(diǎn)開(kāi)關(guān)、檢測(cè)底物加到紙片上并凍干，水化后即可啟動(dòng)反應(yīng)，通過(guò)判斷紙盤(pán)的顏色變化，判斷檢測(cè)結(jié)果，間接反映病毒RNA的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 磁性納米顆粒技術(shù)

磁性納米顆粒技術(shù)是將納米顆粒與某種分子相連，這種分子可有效的與病毒作用，通過(guò)磁性收集，富集病毒。但納米顆粒有不穩(wěn)定性，為了克服這一缺陷，使用石墨、二氧化硅或多聚物包裹磁性納米顆粒，用以提高化學(xué)穩(wěn)定性[4]。Sakudo[5]使用包裹石墨的磁性納米顆粒，表面結(jié)合抗DENV抗體后，建立了可敏感檢測(cè)DENV的新型檢測(cè)技術(shù)，且通過(guò)此方法富集的病毒可進(jìn)行RT-PCR分析。

Tian[6]將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與磁性納米顆粒結(jié)合，建立了ZIKV寡核苷酸檢測(cè)方法，可在aM級(jí)別進(jìn)行核酸的檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)顯著增加了鏈霉親和素-磁性納米顆粒的流體動(dòng)力學(xué)體積，導(dǎo)致Brownian弛豫特征頻率的改變，可通過(guò)便攜式交流磁化率計(jì)進(jìn)行信號(hào)的收集，進(jìn)而定量ZIKV寡核苷酸含量。建立的方法對(duì)合成的ZIKV寡核苷酸的靈敏度為1aM，反應(yīng)時(shí)間僅需27min。這種新型策略為診斷和控制ZIKV提供新方向。

1.5 商品化試劑盒

基于長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，針對(duì)多種病毒的商品化的血清診斷試劑盒會(huì)日益增多。但最近一段時(shí)間，涉足商品化市場(chǎng)的試劑盒較少，檢測(cè)方法主要為抗體檢測(cè)方法和RT-PCR檢測(cè)方法。MyBiosource公司預(yù)計(jì)在美國(guó)上市ZIKV IgG/IgM ELISA試劑盒，原理是基于雙抗原夾心ELISA方法，但關(guān)于制備ELISA時(shí)使用的抗原信息、交叉反應(yīng)情況均無(wú)法獲悉。此外，還有美國(guó)InBIOS公司的ZIKV IgM ELISA、Mac ELISA試劑盒、德國(guó)Altona公司的Real star ZIKV熒光定量試劑盒、日本Tanaka Diagnostics公司的針對(duì)ZIKV的免疫色譜試劑盒、馬耳他Fast-Track公司的快速診斷多重RT-PCR試劑盒、美國(guó)Quest公司的針對(duì)ZIKV/DENV的RT-PCR試劑盒和針對(duì)ZIKV IgM的MAC-ELISA 試劑盒[5]。

2 新型診斷方法設(shè)想

由于ZIKV與DENV有序列同源性，因此在檢測(cè)技術(shù)和疫苗研發(fā)策略中，DENV方面的進(jìn)展對(duì)ZIKV工作的推進(jìn)，也有一定的參考，提供了方向和思路?；谥|(zhì)體技術(shù)為基礎(chǔ)的生物傳感器為建立快速、低廉、可基層操作并可定量的檢測(cè)RNA技術(shù)提供可能[4,6]。

2.1 脂質(zhì)體-免疫層析技術(shù)

Baeumner[7]利用在聚醚砜膜上進(jìn)行DNA/RNA雜交進(jìn)而檢測(cè)脂質(zhì)體信號(hào)的原理，建立了檢測(cè)DENV的生物傳感器。作者先將普通的DNA探針與包有染料（磺酰羅丹明B）的脂質(zhì)體連接，形成磷脂復(fù)合物，再將保守或DENV血清特異性探針固定在聚醚砜膜上。最后通過(guò)肉眼觀察是否有粉色條帶出現(xiàn)即可判斷結(jié)果，或者使用便攜式反射計(jì)對(duì)脂質(zhì)體定量，間接反映病毒含量。Yafaev[8]基于此項(xiàng)技術(shù)，建立了可檢測(cè)DENV 4個(gè)血清型的生物傳感器，不同血清間區(qū)分有92%準(zhǔn)確性。

2.2 免疫脂質(zhì)體-熒光免疫測(cè)定

當(dāng)磺酰羅丹明 B高濃度包裹脂質(zhì)體后，可自我淬滅。因此，科學(xué)家們將磺酰羅丹明 B包裹入脂質(zhì)體中，后期通過(guò)加入試劑裂解脂質(zhì)體，釋放熒光，檢測(cè)目的信號(hào)。且隨著脂質(zhì)體體積的增加，由于被包裹的磺酰羅丹明 B數(shù)量增多，因此熒光信號(hào)會(huì)更強(qiáng)[5]。這種策略已在針對(duì)多種病毒的Elisa方法中應(yīng)用。此外，使用DNA適配體代替抗體與含有熒光的脂質(zhì)體連接也可作為一種選擇[4]，其中DNA適配體有諸多優(yōu)勢(shì)，例如穩(wěn)定、易生產(chǎn)、易修飾從而增加親和性和選擇性、有再生可能、分子量小[5]。

2.3 免疫脂質(zhì)體-磁性納米顆粒技術(shù)

Connelly[6]針對(duì)貓杯狀病毒 （feline calicivirus，F(xiàn)CV）建立了一種檢測(cè)方法，即進(jìn)行了預(yù)先富集病毒，是先將待檢病毒與含有熒光素和單抗的脂質(zhì)體作用，再加到有標(biāo)記多抗的磁性納米顆粒固定基質(zhì)上，實(shí)現(xiàn)預(yù)先富集；最后裂解脂質(zhì)體，釋放熒光，間接定量病毒含量。

3 小結(jié)

每種診斷技術(shù)都有其優(yōu)勢(shì)和局限。RT-PCR檢測(cè)方法較為準(zhǔn)確，但需要昂貴的設(shè)備，在偏遠(yuǎn)、不發(fā)達(dá)地區(qū)不容易實(shí)現(xiàn)?？贵w檢測(cè)方法只適用于急性和/或恢復(fù)期樣品，因?yàn)樵诟腥驹缙贗gM和IgG抗體滴度較低。且如果病人以前感染過(guò)其他黃病毒屬成員，在檢測(cè)寨卡病毒時(shí)，可能由于抗體交叉反應(yīng)而影響檢測(cè)結(jié)果。因此，亟需研制一種快速、低廉、便攜的診斷方法。此外，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多方位 （例如同時(shí)檢測(cè)RNA和IgM）的多重診斷方法[6]很有實(shí)用性，因?yàn)榭赏瑫r(shí)覆蓋ZIKA病毒感染的整個(gè)時(shí)期，對(duì)疑似病人出現(xiàn)發(fā)熱或其他癥狀時(shí)的檢測(cè)很有幫助。從臨床和流行病學(xué)方面考慮，還需建立可同時(shí)檢測(cè)、區(qū)分多種病毒（尤其是ZIKA、DENV、CHIKV）的多重診斷方法。

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