雞毒支原體的分子鑒定及其脂蛋白基因的生物信息學分析

簡瑩娜,張學勇,李秀萍,王光華,蔡其剛,王戈平,馬利青

(1.青海大學畜牧獸醫科學院 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室,青海 西寧 810016;2.青海省畜牧獸醫科學院,青海 西寧 810016)

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,M.gallisepticum)是引起雞呼吸困難、氣囊炎等癥狀的慢性呼吸道疾病的病原體,雞毒支原體感染又稱為慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease,CRD)。M.gallisepticum感染的臨床癥狀表現為咳嗽、流鼻涕、呼吸時發出啰音,嚴重時張口呼吸,在集約型的雞養殖場中容易發生CRD;CRD在世界各地均有發生,該病通過水平和垂直方式傳播,且極易在雞場中隱性存在蔓延。據統計,M.gallisepticum的雞群血清學調查感染率50%以上[1-2],感染此病后,雞群的產蛋率下降、體重減輕、出欄周期延長,且飼料轉化率降低,不僅增加額外藥費開支,而且引起禽產品的藥物殘留,所以此病是威脅養雞業發展的重要疾病之一。脂蛋白(Lipoprotein,LP)是M.gallisepticum的重要結構蛋白之一,在M.gallisepticum與宿主間相互作用中發揮重要作用,脂蛋白在M.gallisepticum的毒力及致病性中也具有重要的生物學作用：粘附作用,致炎性反應和誘導細胞凋亡[3]。本文對雞場中的疑似M.gallisepticum感染的病雞進行病原的分子生物學鑒定,并對其脂蛋白基因進行克隆及全面的生物信息學分析,為進一步研究其生物學功能及其在疫苗和藥靶研究中的應用提供線索。為了更好地分析脂蛋白抗原相位變異及其基因多態性,以及脂蛋白變異在支原體致病力方面的影響和重要生物學意義提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集處理 對疑似雞毒支原體病雞尸體進行臨床癥狀觀察,切開氣道觀察氣管黏膜及氣囊、肺臟。其次,剪取0.5 cm3大小的組織塊分別放入新的Eppendorf管中,用剪刀剪碎組織,利用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取試劑盒提取DNA,具體操作步驟按照試劑盒使用說明書進行,DNA置于-20℃長期保存。

1.2 分子生物學鑒定 利用雞毒支原體crmA基因[9]和lipoprotein基因[10]建立的檢測方法,設計引物及實驗反應程序進行PCR鑒定。PCR方法所用的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(見表1)。PCR擴增酶為寶生物工程(大連)有限公司的PremixTaq酶,擴增反應體系如表2。擴增后產物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳,再在凝膠成像儀中觀察拍照。

表1 雞毒支原體分子鑒定所用引物

表2 PCR反應液配制 (體系為50 μL)

1.3 基因測序分析 PCR陽性產物測序委托北京金唯智生物科技有限公司完成,采用Sanger雙脫氧鏈終止法進行雙向測序。測序結果經峰圖分析后,再在GenBank上用BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源序列搜索,應用MEGA5.0軟件進行比對分析。

1.4 脂蛋白(部分)特性分析 將lipoprotein基因翻譯成蛋白序列,雙向比對后在ExPASy(http：//www.expasy.org/)數據分析系統中,進行蛋白特性預測。采用 TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/ser-vices/SignalP/)程序分析LP蛋白的分泌信號肽和信號肽酶剪切位點;利用HMMTOP(http：//www.enzim.hu/hmmtop/index.php)和TMHMM-2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析LP蛋白的跨膜區域,應用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)分析LP蛋白質的親/疏水性。采用 SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件進行LP蛋白二級結構預測;利用Predicted Antigenic Peptides(http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)進行抗原表位分析。

1.5 序列比對與系統發育樹的構建 通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務軟件獲取其他雞毒支原體的LP蛋白的基因序列。使用MEGA5.0軟件的系統發育樹構建功能對這些基因序列進行分析,選擇鄰近法(Neighbor-Joining method,NJ)構建系統發育樹,并使用自展值(Bootstrap)檢驗其可靠性,重復次數為2 000,分析不同分離株雞毒支原體lipoprotein基因間的進化關系。

2 結果

2.1 分子生物學鑒定 使用基因組DNA提取試劑盒提取DNA后,基于crmA基因進行PCR擴增,擴增出288 bp的目的片段(如圖1);同時基于lipoprotein基因再次進行PCR擴增鑒定,擴增出726 bp的目的片段(如圖2),將PCR產物進行測序,所得序列在GenBank用BLAST進行同源序列搜索并上傳至GenBank,均與M.gallisepticum S6株全基因組比對(CP006916)同源性均在95%以上。

圖1 CrmA基因擴增結果

圖2 lipoprotein基因擴增結果

2.2 脂蛋白基本性質分析 經過ExpASy在線系統分析,此段LP蛋白長度214個氨基酸,分子量大小為23.74 kDa,等電點(pI)為4.99;帶正(Arg+Lys)負(Asp+Glu)電荷氨基酸殘基數為20和24。LP蛋白在280 nm處的摩爾消光系數為20 400 mol-1·cm-1及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值為0.859;LP在溶液中的不穩定指數為15.88(閾值＜40),推測LP為穩定蛋白;LP的脂肪族指數為59.72,親水性平均系數(GRAVY)為-0.703,蛋白總體親水性較低。此段LP蛋白序列信號肽預測cutoff值為0.450(＜0.9),此段蛋白無信號肽和信號肽酶剪切位點。預測可見,LP蛋白為非跨膜蛋白,為膜外蛋白且是疏水蛋白;LP蛋白二級結構預測分析發現α螺旋比例為37.85%,β轉角比例為9.81%,無規則卷曲比例為39.72%,延伸鏈比例為12.62%,可見LP蛋白的二級結構以無規則卷曲為主(如圖3)。對LP蛋白的氨基酸序列中潛在的抗原表位做進一步分析,顯示有5個潛在的抗原表位,且平均抗原傾向性系數為0.9870,LP蛋白含有較多的優勢抗原表位結構,可作為一種免疫原性蛋白。

圖3 脂蛋白預測三維構象圖

2.3 系統發育樹的構建 通過MAGE5.0軟件構建的NJ樹如圖4所示,其中本研究克隆序列(Gen-Bank登錄號KY088057)與美國分離株AY556082聚在一支,可見在系統發育樹上發現二者之間的進化距離最近。這為后續從分子遺傳學角度探索lipoprotein基因功能提供研究思路。

3 討論

圖4 不同分離株雞毒支原體lipoprotein基因的系統發育分析

本試驗鑒定的M.gallisepticum,分離自養殖場的疑似雞毒支原體病例,采用PCR方法利用crmA基因和lipoprotein基因進行分子鑒定,都獲得了預期片段大小,通過對相應樣品進行測序,進一步確認為M.gallisepticum。由于M.gallisepticum引起的慢性呼吸道病為接觸性傳染病很難凈化,可以在雞場中長期蔓延,且易復發,加上與其他疾病如大腸桿菌病和傳染性支氣管炎等并發或繼發感染[7]。特別是在集約化程度較高、管理不善、環境不佳、氣溫驟變等因素都會促進M.gallisepticum隱性感染的雞群發病或引起M.gallisepticum的感染[6-7]。M.gallisepticum單獨感染多呈現亞臨床感染癥狀,死亡率較低,基本在10%以下,與其他病原混合感染或繼發感染時,M.gallisepticum感染加重,死亡率會提高至30%以上[8-9]。在我國的廣東省、廣西省、山東省的雞場都曾發生呼吸道疾病,且鑒定分離到M.gallisepticum[10-12],同時在西藏和青海地區自然養殖與集約化養殖的雞群中也廣泛流行著由M.gallisepticum感染引起的呼吸道疾病[13-14]。可見,M.gallisepticum感染已成為威脅養雞業的隱形病原。

新型有效的疫苗是預防M.gallisepticum感染的有效手段,但是其表面抗原具有不斷改變的能力,且通過抗原變異性來逃避宿主的免疫抵抗[5],因此對重要結構蛋白之一的脂蛋白基因進行克隆分析,該蛋白總體親水性較低,為疏水性蛋白,二級結構包括α螺旋、β轉角、無規則卷曲和延伸鏈。同時發現,脂蛋白有5個潛在的優勢抗原表位,可作為一種免疫原性蛋白。這些分析為該蛋白功能的進一步研究提供了數據支撐。

M.gallisepticum作為引起雞慢性呼吸道病的主要病原之一,可能在本地區長期存在蔓延感染,造成養雞業巨大的經濟損失。因此,對本地區分離株病原進行分子鑒定研究,對診斷預防該病的發生都具有重要的現實意義;借此提示控制此病的發生流行,堅持疫苗和藥物預防,加強飼料營養管理,注重禽舍內通風空氣交換,控制疾病水平傳播,注意處理種蛋的垂直傳播,凈化雞群,積極防治M.gallisepticum感染的發生。