潼白蒺藜藥對調節高脂血癥模型大鼠血脂作用及機制研究＊

楊愛玲，樊 華，王佑華＊＊，彭瓏萍，周 莉，湯 諾，鄧 兵，周 端

（1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院心內科 上海 200032；2.上海市徐匯區中心醫院中醫科 上海 200031）

高脂血癥在心腦血管疾病和發展過程中起著重要作用，人群血脂水平的大幅度提升是我國冠心病發病率和死亡率增加的最主要致病性因素[1,2]。調節血脂代謝紊亂，降低血脂水平可明顯降低冠狀動脈硬化性心臟病和中風的發生率[3,4]；有效地控制高脂血癥是預防心腦血管疾病的關鍵。從中醫藥中尋找更多安全、有效的調脂藥物是醫藥學界關注的熱點和難點。

藥對又稱對藥，是臨床中藥配伍中相對固定的兩味藥物的搭配形式。藥對體現了中醫遣方用藥的特色優勢，具有內在的組合變化規律，發揮著協同增效或配伍減毒等作用[5,6]。潼蒺藜、白蒺藜藥對是臨床常用藥對，名醫施今墨先生即善用潼白蒺藜藥對治療心血管在內的諸多疾病[7]。白蒺藜以升為主，潼蒺藜以降為要。二藥伍用，一升一降，肝腎同治，平肝滋腎之功益彰，兼以祛瘀瀉濕，適用于高脂血癥的治療。我們以潼白蒺藜藥對制成潼白顆粒，臨床收到較好效果。本研究采用高脂血癥大鼠模型，觀察潼白顆粒對高脂血癥大鼠血脂水平調節的作用及機制，報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠48只，SPF級，6-8周齡，體質量180±20 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2015-0001。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，飼養環境溫度在24±2℃之間，濕度為40%±5%，定期更換墊料，自由采食、飲水，每天給予光照與黑夜時間各12 h。

1.2 藥物及試劑

潼蒺藜及白蒺藜藥材藥材飲片及購自上海華濟藥業有限公司，批號：16113004，藥物經我院藥劑科制備成水提物顆粒，4℃冷藏備用。辛伐他汀片購于杭州默沙東制藥有限公司；甘油三酯（TG）試劑盒、膽固醇（TC）試劑盒、高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒及低密度脂蛋白（LDL-C）試劑盒購于南京建成生物有限公司；Real time PCR（RT-PCR）試劑盒及Trizol購于TaKaRa公司；全部引物由上海生物工程股份有限公司合成；BCA蛋白定量測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自碧云天公司；二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，一抗兔抗鼠HMGCR、CYP7A1、LDL-R均購自美國Abcam有限公司。

1.3 儀器

Olympus AU27oo全自動生化分析儀（日本）；L720R-3低溫離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；電子分析天平（沈陽龍騰電子稱量儀器廠），Rt2100c酶標檢測儀（中國Rayto公司），QuantStudio Real-Time PCR儀（美國ABI公司），ChemiDoc MP成像儀（Biorad）。

1.4 飼料

正常大鼠飼料組成：蛋白質（14%），脂肪（10%）和碳水化合物（76%）。高脂飼料組成：標準的大鼠飼料輔以膽酸（1%），膽固醇（3%）和花生油（5.5%），購于上海中醫藥大學動物實驗中心。

2 方法

2.1 動物分組及喂養

適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為正常對照組，模型組，辛伐他汀組、白蒺藜組、潼蒺藜組及潼白蒺藜組，每組各8只。參照文獻[8]制備高脂血癥大鼠模型，正常對照組飼喂基礎飼料，其余各組大鼠均用高脂飼料喂養，周期共6周。

表1 各基因引物序列

2.2 給藥劑量及方法

在造模的同時給予預防性灌胃給藥，按等效臨床劑量及體表面積公式計算，辛伐他汀組給予辛伐他汀7.5 mg·kg-1·d-1，白蒺藜組給予白蒺藜水提物600 mg·kg-1·d-1，潼蒺藜組給予潼蒺藜水提物600 mg·kg-1·d-1，潼白蒺藜組給予潼白蒺藜藥對水提物（潼蒺藜：白蒺藜=1∶1）600 mg·kg-1·d-1，正常對照組及模型組灌以等劑量的蒸餾水，給藥容積為10 mL·kg-1·d-1，每天1次，共持續6周。

2.3 血液及組織樣本采集

于給藥第6周末，各組大鼠均禁食12 h，不禁水，于次日上午稱體質量后用乙醚全麻，腹主動脈取血，收集血漿2 mL，靜置30 min，于低溫離心機4℃，3000 r·min-1，離心5 min，分離血清，-20℃冰箱保存待測。解剖大鼠，快速取出肝、腎、心等臟器組織，稱取質量，計算臟器指數[臟器指數（%）=臟器質量（mg）/體質量（g）×100%]；將肝組織部分迅速置于非凍型組織RNA保存液中，部分保存于-20℃冰箱中，待測。

2.4 血脂測定

在全自動生化分析儀上，用酶法測定TC、TG含量。免疫比濁法測定LDL-C、HDL-C含量。

2.5 肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDL-R mRNA表達水平的測定

Trizol處理各組肝臟組織，提取總RNA，逆轉錄成cDNA，設定PCR反應條件，用SYBER Green試劑盒，以18sRNA為內參，應用RT-PCR法檢測待測基因的mRNA水平，循環條件為：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃20 s，72℃30 s（40個循環）。各基因引物序列如表1。

2.6 肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表達水平的測定

蛋白裂解液提取各組肝臟組織蛋白，利用BCA（Bicinchoninic acid）法對蛋白進行定量。以30 μg蛋白/泳道上樣，經SDS-PAGE電泳后，用濕轉法將蛋白轉印置于甲醇活化后的PVDF膜上，blocking buffer室溫封閉30 min后，進行一抗（濃度為1∶1000）4℃孵育過夜（≥12 h），并與β-actin作為內參抗體。孵育完畢后，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBST）漂洗10 min×4次后進行HRP偶聯的二抗（濃度為1 3000）室溫孵育1 h，PBST漂洗5 min× 3次后在Biorad ChemiDoc MP顯影儀中用ECL發光液進行化學發光顯影。

表2 各組體重及臟器指數比較

表3 各組血脂比較

3 統計學處理

RT-PCR結果采用相對定量-△△Ct法分析。蛋白灰度值采用Biorad公司Image Lab?軟件進行定量分析，所有實驗結果采用SPSS21.0軟件進行檢驗，用x±s表示，其中多組間均數比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

4 實驗結果

4.1 各組體重及臟器指數比較

如表2所示，造模四周后各組大鼠體重、腎指數及心指數沒有明顯變化（P均＞0.05），與正常組相比，模型組肝指數顯著增加，與模型組比較，辛伐他汀組、潼蒺藜組、白蒺藜組及潼白蒺藜組肝指數有顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），各藥物之間肝指數沒有明顯變化。

4.2 各組血脂比較

如表3所示，與正常對照組相比，模型組血清CHOL，TG，LDL-C均明顯升高，而血清HDL-C明顯降低（P均＜0.01），說明高脂血癥大鼠模型成功建立。與模型組相比：辛伐他汀組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。HDL-C沒有明顯變化。白蒺藜組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。HDL-C沒有明顯變化。潼蒺藜組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.01），HDL-C明顯上升（P＜0.05），潼白蒺藜藥對組TG、TC及LDL-C明顯下降（P＜0.01），HDL-C明顯上升（P＜0.01），其中以潼白蒺藜藥對組降脂作用更加明顯。

4.3 各組肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA相對表達水平比較

如表4所示，與正常對照組比較，模型組HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA表達水平明顯下降（P＜0.01）。而與模型組相比，辛伐他汀組、白蒺藜組、潼蒺藜組、潼白蒺藜組HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA表達水平均明顯上升（P＜0.01）。其中潼白蒺藜組CYP7A1、LDLR mRNA表達變化更為明顯。

4.4 各組肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表達水平比較

如圖1所示，與正常組比較，模型組HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表達水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，辛伐他汀組、白蒺藜組、潼蒺藜組、潼白蒺藜組HMGCR、CYP7A1、LDLR表達水平均明顯上升（P＜0.05或P＜0.01）。其中潼白蒺藜組CYP7A1、LDLR表達變化更為明顯。

5 討論

中醫學多把高脂血癥歸屬于痰濁、血瘀、胸痹、眩暈、肥胖、污血、中風等范疇，認為與肝脾腎等臟相關。肝失條達，肝脾失調，氣血失和，脾胃運化受納和升清降濁失常，致膏脂轉運輸布不利，久則脂濁滯留于營血，停于血脈，形成高梁之疾。此外，腎為先天之本，主津液。腎精虧耗則水不涵木，肝木失其疏泄，則脂質代謝失調，發展為高脂血癥。刺蒺藜功在疏肝解郁、祛風明目、散結祛瘀，潼蒺藜則著重于補益肝腎、明目固精，二者為臨床常用藥對，二藥一升一降，肝腎同治，升降調和，理氣散瘀，平補肝腎之功增強。清代名醫施今墨常以刺蒺藜與潼蒺藜藥對共伍，治療包括高脂血癥在內的諸多心血管病證肝腎不足者，二藥合參，一散一補，一平肝陽以治上，一補腎陰以治下，腎氣得充，肝得疏泄，氣血通暢，發揮治療作用。

圖1 各組HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA相對表達水平比較

圖2 各組肝組織中HMGCR、CYP7A1、LDL-R蛋白表達水平比較

現代醫學表明，高脂血癥是指血清中脂質成分過剩的狀態，是由于脂肪代謝或運轉異常所導致。血清總膽固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C是反映機體脂質代謝的主要指標[9,10]。而肝臟是體內脂質代謝的重要器官，研究發現，長期飼喂高膽固醇飲食后，會引起肝腫大[11]。另外，TC合成、吸收、代謝在高脂血癥發生發展中具有重要作用。一方面，在合成過程中，TC受其限速酶HMG的調節[12]，而HMGCR的濃度亦受TC的反饋調節，TC濃度升高會導致HMGCR蛋白水平降低，進而使TC的生物合成減少，達到動態平衡。故通過調節HMGCR蛋白水平可以起到減少TC生成的作用。另一方面，在TC的代謝過程中，合成膽汁酸是TC代謝的一個重要途徑，而CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶[13]，它的表達量和活性對膽汁酸的合成起關鍵作用。當發生高脂血癥時，CYP7A1活性表達下降，使TC代謝受阻，此時TC不能轉變為膽汁酸，沉積體內，導致TC增高；同時，LDL-R是另一條維持機體血漿LDL-C水平及血脂代謝的重要途徑，血漿中90%的膽固醇通過LDL-R途徑清除[14]。LDL-R是細胞表面的一種糖蛋白，主要在肝臟中合成，當LDL-R的數量、結構及功能異常時，會導致TC含量升高，并在組織內沉積，進而導致各種心血管疾病的發生[15]。而高TC反過來影響肝細胞表面LDL-R受體,使其活性減弱，肝細胞攝取、轉化及排泄LDL-C減少，進一步引起血中TC和TG升高[16]。

以往研究報道潼蒺藜、白蒺藜具有降脂作用[17-19]，但其機制尚未明確，潼白蒺藜作為藥對使用對高脂血癥的作用機制亦鮮有報道。本研究結果顯示，高脂飼料喂養后大鼠血清TG、TC、LDL-C明顯增加，HDL-C明顯降低，大鼠肝指數顯著升高，表明高脂模型建立成功。潼蒺藜、白蒺藜及潼白蒺藜藥對干預后，明顯降低大鼠血清TG、TC、LDL-C及肝指數，明顯升高HDL-C，提示潼蒺藜和白蒺藜具有降低血脂，保護肝臟的作用，與既往研究一致。且與單用潼蒺藜或白蒺藜相比，潼白蒺藜藥對組降低TC與LDL-C的效果更加顯著。提示應用潼白蒺藜藥對治療高脂血癥，或有協同增效的作用。同時，PCR及Western blot結果顯示白蒺藜組、潼蒺藜組及潼白蒺藜藥對組可明顯提高HMGCR、CYP7A1、LDL-R mRNA及蛋白表達水平，且與單用潼蒺藜，白蒺藜相比，潼白蒺藜藥對升高CYP7A1、LDLR蛋白水平的效果更加顯著。提示潼白蒺藜藥對可能通過調節HMGCR表達進而減少TC生成，同時促進CYP7A1、LDL-R的表達，既促進TC轉化為膽汁酸，又增加TC的逆轉運，從而降低血清TC水平起到降脂的作用。

綜上所述，潼白蒺藜藥對可通過調節HMGCR的表達來減少TC的生成，并通過提高CYP7A1、LDLR活性及表達來促進TC的代謝，進而降低血漿血漿TC含量，對高脂血癥具有一定的治療作用并且發揮協同作用。本研究為臨床應用潼白蒺藜藥對治療高脂血癥提供了重要的參考意義，其具體的作用機制及潼白蒺藜配伍應用的獨特療效仍需進一步研究。