皖貝母產生物堿內生真菌的篩選與鑒定＊

許 勇，戴陳偉，董朝陽，蔡 標

（安徽省醫學科學研究院微生物研究所 合肥 230061）

貝母皖貝母為百合科（Liliaceae）貝母屬（FritillariaL.）植物安徽貝母（Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin）的干燥鱗莖，1985年被認定為國家一類新藥，自然分布于大別山區與江淮丘陵區，具有清熱、化痰、止咳鎮喘等功效[1-2]，可用于治療急、慢性支氣管炎等疾病[3]。研究發現，皖貝母的主要活性成分為異甾生物堿，如貝母素甲和貝母素乙等[4]。近年來，由于全球氣溫變暖，肺疾增多，貝母的需求量急增，導致野生資源采挖過度，以及農戶種植傾向的變化，皖貝母藥用資源已經比較匱乏[1,5]。

植物內生菌是指那些其全部或部分生活史在健康植物的各種組織或細胞內部度過的真菌或細菌（包括放線菌），其存在不引起明顯的宿主感染癥狀，但可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離[6]。植物內部存在真菌的現象十分普遍[7]，具有促進植物生長、合成植物激素、增加植物抗脅迫能力、提高植物光合作用和抗病抗蟲能力等作用[8]。內生真菌長期生活在植株體內的特殊環境中與其協同進化，能夠產生與宿主植物相同或相似的次生代謝產物[9]，甚至新的化合物[10]。1993年，美國科學家Stierle首次從內生真菌中分離出了和宿主相同的具有抗癌作用的活性物質[11]。近年來，藥用植物內生真菌產抗菌類活性物質、抗腫瘤和抗氧化活性類物質、免疫抑制活性物質和其他活性物質等方面的研究越來越多，成為內生真菌研究的熱點領域[9]。從藥用植物中分離篩選出了產活性物質的內生真菌，借內生真菌產生的新型化合物填充天然藥用的資源庫，成為緩解藥用資源緊張的局面的一條途徑。厲秀秀等從黃連（Coptis chinensisFranch.）中篩選出了產小檗堿的擬莖點霉屬內生真菌（Phomopsis）[12]，侯曉強等從鐵皮石斛（Dendrobium officinale）分離出了8株具有促生長活性的內生真菌[13]，畢江濤等從藥用植物車前（Plantago asiaticaL.）內分離出11株內生真菌對1種或多種植物病原真菌指示菌有不同程度的抑制作用[14]。

目前，尚未見有關從皖貝母中分離出產活性成分的內生真菌報道，本試驗對皖貝母內生真菌進行分離，并對這些內生真菌的代謝產物進行檢測，旨在從皖貝母中篩選出能夠產生物堿的內生真菌，為解決皖貝母藥用資源匱乏的問題提供理論依據。

圖1 內生真菌bm-2菌株產生物堿的TLC分析

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

貝母采自安徽省霍山縣太平畈鄉農戶家中，由安徽中醫藥大學王德群教授鑒定為安徽貝母（Fritillaria anhuiensisS.C.Chen et S.P.Yin）。

1.1.2 儀器與試劑

JK-300超聲波清洗器（金尼克）；SQ810C壓力滅菌器（YAMATO）；U3000高效液相色譜儀（（Thermo Fisher）；3300旋轉蒸發光檢測器（Alltech）；MJX-160B-Z霉菌培養箱（博訊）；Veriti梯度PCR儀（ABI）；SW-CJ-ID 超 凈 工 作 臺（AIRTECH）；ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（Waters）。貝母素甲和貝母素乙標準品購于成都普菲德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離與純化

取安徽貝母鱗莖部位，在無菌條件下將表面清洗干凈，晾干后用75%酒精浸泡1.5 min，無菌水沖洗1次，84消毒液浸泡5 min，無菌水沖洗1次，再用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗干凈。將鱗莖切割成0.5*0.5 cm2的塊狀，截面向下置于含青霉素的馬鈴薯葡萄糖培養基（Potato Dextrose Agar，PDA），最后一次沖洗液作為對照。28℃條件下培養，觀察期間菌落形態、顏色等特征，將形態、顏色不同的菌落轉接到新的固態培養基上，編號，28℃培養3-7天，放入4℃冰箱保存[3,15]。

1.2.2 內生真菌發酵液及標準溶液的制備

將菌種于PDA培養基活化4天后，取直徑為6 mm的菌塊接種到PDA液體培養基中（100 mL 250 mL-1），置于26℃恒溫搖床中130 r min-1培養7天。收集發酵液，60℃減壓濃縮至5 mL，加濃氨水調至pH 9-11，20 mL二氯甲烷萃取2-3次，收集油層，揮干，用0.5 mL甲醇定容，制得樣品制備液[15]。

取貝母素甲對照品和貝母素乙對照品，加三氯甲烷分別制成每1 ml各含0.2 mg和0.15 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

1.2.3 薄層層析（Thin Layer Chromatography，TLC）檢測

吸取樣品制備液 10～20 μl、對照品溶液 10 μl，分別點于薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。

1.2.4 高效液相色譜-旋轉蒸發光檢測器分析（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector，HPLC-ELSD）

色譜條件：色譜柱C18，100 ×2.1 mm，1.7 μm；流動相：乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.03）；流速：0.2 mL·min-1。ELSD參數設置為霧化溫度65℃，蒸發管溫度70℃，氣體流速1.6 L?min-1。分別精密吸取對照品溶液10 μl、20 μl，供試品溶液5-15 μl，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程分別計算貝母素甲、貝母素乙的含量。

1.2.5 形態學鑒定

將菌株接種于PDA培養基上，置于霉菌培養箱中，25℃培養15天，觀察菌落生長情況，記錄菌落的菌群特征，并于顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗、產孢結構的形態特征，參照《真菌鑒定手冊》中的描述，對真菌進行鑒定[15,16]。

1.2.6 分子生物學鑒定

以真菌通用引物ITS4，擴增真菌的ITS序列測序委托測序公司完成。根據真菌的ITS序列，用MEGA 7構建分子進化樹，采用Neighbor-Joining法的Complete Deletion模式建樹，用Bootstrap進行檢驗，并重復1000次[17]。

2 結果與分析

2.1 產生物堿內生真菌的篩選

從皖貝母的鱗莖中共分離得到6株內生真菌。如圖1所示，利用TLC法對該6株內生真菌樣品制備液進行鑒定發現，菌株bm-2樣品制備液中出現一個斑點與貝母素甲的遷移率一致，Rf值為0.676。另有一處斑點與在貝母素乙標準品斑點附近，但不完全一致，Rf值為0.781。

2.2 內生真菌bm-2產貝母生物堿分析

對bm-2菌株樣品制備液進行HPLC-ELSD分析，最高峰出峰時間為3.803 min（圖2-A），貝母素甲標準溶液出峰時間為3.844 min（圖2-B），二者出峰時間非常接近，表明內生真菌bm-2能夠產生與貝母素甲相同或者相似的化合物。在貝母素乙的出峰時間4.296 min附近（圖2-C），bm-2菌株粗提液并未出現峰值（圖2-A），這表明其中未發現與貝母素乙相同或相似的化合物。根據圖2-A峰面積，計算出bm-2菌株發酵液貝母素甲的產量為0.7353 mg?L-1。

2.3 形態學鑒定結果

bm-2菌株在平板上菌落形態：初期生長呈絨毛狀，白色或灰黑色。后期生長疏松，呈棉絮狀。顯微鏡觀察：分生孢子梗直接從菌絲上長出，與菌絲無明顯差異，在頂端形成分生孢子。分生孢子呈卵形，成串排列（圖3）。根據菌落形態和顯微特征，參照《真菌鑒定手冊》的特征描述，初步推斷其為極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）。

2.4 分子生物學鑒定結果

如圖4所示，內生真菌bm-2的ITS序列長度約在750 bp，其擴增條帶清晰。經ITS序列比對，發現bm-2的ITS序列與極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）的同源度達到100%。由bm-2的ITS序列與其他相似度高且具代表性的序列，以親緣關系較近的忍冬黑痣菌（Rhytisma lonicerae）為外類群構建系統進化樹（圖5），結合形態學鑒定結果，將bm-2確認為極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）。

圖2 bm-2樣品制備液的HPLC分析

3 討論

為緩解貝母藥用資源的匱乏，研究者們嘗試從貝母中篩選鑒定具備藥用活性的內生真菌。陳鵲等從甘肅貝母中分離出了一株具有抑菌活性的鐮刀菌屬接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）[15]，陳娟麗等從平貝母中篩選出了可產西貝母堿的頭孢霉屬真菌（Cephalosporium）[18]，潘峰等從瓦布貝母中分離出了一株能夠產貝母辛和貝母素乙的鐮刀屬真菌（Fusarium）[19]，但尚未發現從皖貝母中篩選分離活性內生真菌的報道。

圖3 bm-2的顯微鏡鑒定

圖4 菌株bm-2的ITS-PCR擴增電泳圖

圖5 菌株bm-2的rDNA-ITS生物分類系統進化樹

本研究通過TLC法從皖貝母的鱗莖中篩選出1株真菌bm-2，其發酵液中含貝母素甲成分。rDNA-ITS序列分析與傳統形態學鑒定相結合是目前鑒定真菌的主要手段[7，9]。rDNA-ITS序列分析結果顯示菌株bm-2與極細鏈格孢菌的同源度達到100%，同時菌株bm-2的形態學特征也與極細鏈格孢菌相吻合。綜合形態學鑒定和分子生物學鑒定結果，將菌株bm-2鑒定為極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）。鏈格孢屬細菌是藥用被子植物內生真菌的優勢菌群[10]，彭三妹等也曾在浙貝母的鱗莖中分離出了交鏈孢霉屬（Alternaria）真菌[20]。楊宇等曾對皖貝母的內生真菌進行過初步探索，從皖貝母中分離出了被孢霉屬（Mortierella）和青霉屬真菌（Penicillium）[3]，與本研究并不相同，這可能是由于肉質組織中的內生真菌的密度和種類隨著植物生長發育環境的不同也有著很大的不同，在很大程度上表現出環境依賴性[7]。

和甘肅貝母、平貝母和瓦布貝母[17]中篩選分離出的產生物堿的內生真菌相同，本研究中篩選獲得的極細鏈格孢發酵液中僅含產量很低的貝母素甲（0.7353 mg·L-1），不含貝母素乙，這種產量水平無法直接進行工業化生產。高楊等以產小檗堿的內生真菌S6為出發菌株，采用多種單一或復合誘變措施對其菌絲體進行誘變處理，最終篩選得到高產菌株s-nu-302，其小檗堿產量比出發菌株提高170%，達到12.28 mg?L-1[21]。殷紅等對s-nu-302的發酵條件進行優化，使該菌株的小檗堿得率提高了47.2%，菌體生物量提高了24%[22]。殷紅等還對平貝母鱗莖中內生真菌菌株fu7的發酵條件進行優化，將菌絲干重和西貝素含量分別比在基本培養基中提高了約155%和77%[23]。除了人工誘變和優化發酵條件以外，通過基因工程手段改造菌株也是提高活性物質產量的可行途徑。

同時，內生真菌離開植物體后，通過反復的繼代培養，合成次生代謝產物的能力會下降，這種退化現象普遍存在，也是限制其活性物質產量穩定的重要因素[8,24]。kusari等、li等都報道了內生真菌的退化現象，這可能是由于在沒有宿州植物特定刺激的情況下，產物基因無法正常表達[25,26]。崔欣等在1株具有產西貝堿能力的平貝母內生真菌的培養基中加入3%平貝母藥材，發現其發酵液中西貝堿產量可達到0.0563 mg?L-1，比出發菌株提高了21.9%，且具有良好的遺傳穩定性[27]。然而kusari等通過將內生真菌接種回宿主植物的方法，雖然恢復了菌株形態，但次生代謝產物量并未恢復[28]。因此，不同的內生真菌或宿主植物其退化機理也不盡相同，探索有效的復壯手段前提是了解真菌合成宿主植物次生代謝產物的分子機制[8]。

由于植物源和微生物源的酶類的聯合作用，微生物的基因表達在植物體內受植物生理環境的影響等原因，內生真菌不僅能夠促進宿主植物合成活性成分，還可自身合成新的藥物活性物質[7,9]。這些化合物一般對病原物有抑制作用，在植物對病原物的能動抗性中起到十分重要的作用[7]。kharwar等發現印度楝的一株內生真菌可以產生能夠顯著抑制人類及植物病原菌的活性物質——爪哇鐮菌素[29]。新化合物的合成往往需要微生物與宿主植物相互作用才能完成，微生物單獨或者植物單獨通常都不能合成[7]。因此，檢測鑒定皖貝母內生真菌所產生的新型化合物及其藥理活性，也是進一步深入研究的方向。如今，根據內生真菌能產生與宿主相同或相似次生代謝產物的理論，人們還能將一些珍貴藥用植物的內生真菌進行擴大培養，提取生物活性次生代謝物，生產新型的大眾化保健飲料[9]。