人工寒潮促發糖尿病大鼠腦卒中發病前腦組織中細胞粘附因子的變化

席秋江，韓莉，樓小亮

(南昌大學第四附屬醫院神經內科，南昌 330003)

流行病學調查和臨床觀察表明，在寒冷季節腦血管病的發病率明顯增高[1-3]，對多項氣象因素的進一步研究發現氣溫驟降是腦血管病最重要的預測因子[4]。關于低溫誘發腦血管病發病的機制還不十分清楚，大多數學者目前認為可能的發生機制有[5，6]：血壓、血脂濃度、纖維蛋白濃度和血小板黏附。血管內皮細胞當受刺激后表達大量的細胞粘附分子，不但可與血小板附著，同時可導致循環中單核細胞進入血管壁，趨化巨噬細胞和T淋巴細胞，進而釋放大量炎性介質，最終導致動脈粥樣斑塊的形成。因此，細胞粘附分子在腦血管病的發生過程中有極其重要的作用。糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是腦血管疾病的主要危險因素之一，與動脈粥樣硬化及血栓形成有關[7]。但細胞粘附分子在寒潮誘發有DM基礎的腦卒中過程中所起的作用尚未明確。本研究利用寒潮作為誘因研究大鼠腦卒中的發病情況，探討腦卒中的發病機制，為針對性預防冬季腦卒中發病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選用健康雄性老年Sprague-Dawley(SD)大白鼠38只。在飼養和寒潮過程中出現腦卒中癥狀和體征的均被剔除。進行分組：分為正常對照寒潮組7只、正常對照非寒潮組7只、DM寒潮組12只和DM非寒潮組12只等4個亞組。

1.2 人工模擬寒潮 按照國家氣象局規定的標準，寒潮是指日平均氣溫在24h內急劇降溫8℃或以上（或48h內降溫10℃或以上），而且整個過程最低氣溫≤5℃。按照Li C[8]模擬人工寒潮，寒潮組置于人工氣候箱（寧波江南儀器廠）中，保持相對濕度65%不變，寒潮溫度設置以22℃ 12h，4℃ 12h為1d一個周期，共3個周期。非寒潮組置于相對濕度65%，溫度22℃的人工氣候箱共3個周期。

1.3 DM模型鼠的制備 參照文獻[9]制作DM模型。

1.4 觀測項目 注射STZ 4周后測量大鼠的體重、空腹血糖和空腹胰島素激素水平，并計算胰島素敏感指數 ISI＝[1/（空腹血糖值×空腹胰島素值）]。寒潮處理前后定期測量體重、空腹血糖和空腹胰島素水平，每天多次觀察大鼠的一般活動情況。

1.5 標本的取材和制備 以寒潮3d、出現偏癱癥狀或意識障礙、死亡為研究終點，在研究終點處死大鼠。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開胸，經主動脈灌流37℃生理鹽水200ml，繼以400ml 4%多聚甲醛固定液灌流固定，取腦入上述固定液中后固定約6h(4℃)后轉入30%蔗糖4℃過夜。第2d行恒冷箱冰凍切片(30μm)。視交叉層面每8張取1張切片作免疫組化；視交叉層面的其余切片及其余腦片連續切片后作HE染色，發生腦卒中者被剔出卒中前狀態的分析。每亞組隨機抽取6只大鼠標本作免疫組化染色。

1.6 免疫組織化學ABC染色 按下列步驟對切片進行免疫組織化學反應(ABC法)：⑴含1%Triton X-100和0.03%H2O2的0.01mol/L PBS室溫30min；⑵含 3%牛血清白蛋白(BSA，Pierce)和 1%正常羊血清 (NGS，Vector)的0.01mol/L PBS室溫30min；⑶兔抗 ICAM-1(1：50，美國 Sigma 公司)、VCAM(1：50，美國 Sigma 公司)、P-選擇素(1：50，美國Sigma公司)，室溫孵育過夜?？贵w用含3%BSA和1%NGS的0.01mol/L PBS稀釋；⑷0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min；⑸生物素化羊抗兔IgG(1：200，Vector) 室溫 2h； ⑹0.01mol/L PBS 漂洗 3次，每次 10min；⑺ABC(1：100，Vector)室溫 2h；⑻0.01mol/L PBS漂洗3次，每次10min；⑼含0.03%DAB和0.006%H2O2的Tris鹽酸緩沖液室溫10-15min。⑽常規脫水、透明、樹脂封片；⑾普通光學顯微鏡觀察，拍照，所得圖片用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件分析。

1.7 統計學分析 數據采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較采用One-Way ANOVA檢驗，多組間均數比較用S-N-K法。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 注射STZ 4周后動物模型評估 DM組注射STZ 4周后共有18只大鼠造模成功。DM組的體重與正常對照組的比較，兩者差異有統計學意義（P<0.05），但DM組的空腹血糖和胰島素水平較正常對照組的明顯增高，差異具有統計學意義 （P<0.01），DM組的胰島素敏感性較正常對照組減低，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。寒潮前DM組大鼠觀察可見三多一少癥狀，毛發和墊料潮濕，而放入寒潮后在開始降溫時大鼠處于一種 “易激惹”狀態，當環境溫度低于10℃時，大鼠逐漸趨于平靜，出現被毛豎立、寒顫，飲水和進食均減少，但排尿增多。在實驗過程中，正常對照組和DM非寒潮組均無卒中癥狀或體征出現，而DM組在寒潮后有1只大鼠Longa評分3分，另2只大鼠死亡。

表1 注射STZ后4周大鼠體重、空腹血糖、胰島素和胰島素敏感性的變化

2.2 免疫組化結果

2.2.1 腦組織中ICAM-1水平表達的變化 各組大鼠腦皮質中均見ICAM-1陽性表達的神經元細胞。正常對照寒潮組與正常對照非寒潮組比較，大腦皮質中的ICAM-1的光密度值無明顯差異 （P>0.05）。DM組與正常對照組比較，DM組的腦皮質中的ICAM-1陽性神經元表達的光密度值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05，）。DM寒潮組與DM非寒潮組比較，DM寒潮組的大鼠腦皮質中的ICAM-1陽性神經元表達的光密度值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。 （見圖 1、圖 3）。

圖1 各組大鼠腦皮質中ICAM-1的表達變化

圖3 各組大鼠腦皮質中ICAM-1光密度值比較

2.2.2 腦組織中VCAM-1水平表達的變化 各組大鼠腦皮質中均可見VCAM-1陽性表達的神經元細胞。正常對照寒潮組與正常對照非寒潮組比較，大腦皮質中的VCAM-1陽性神經元表達的光密度值無明顯差異 （P>0.05）。DM組與正常對照組比較，DM組大鼠的腦皮質中VCAM-1陽性神經元表達的光密度值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。DM寒潮組與DM非寒潮組比較，DM寒潮組的大鼠腦皮質中VCAM-1陽性神經元表達的光密度值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。（見圖 2、圖 4）。

圖2 各組大鼠腦皮質中VCAM-1的表達變化

圖4 各組大鼠腦皮質中VCAM-1光密度值比較

2.2.3 腦組織中P一選擇素水平表達的變化 各組大鼠腦皮質、海馬、丘腦中均可見P-選擇素陽性表達的神經元細胞，尤以腦皮質表達顯著。正常對照寒潮組與正常對照非寒潮組比較，大腦皮質中的P-選擇素陽性神經元表達的光密度值無明顯差異 （P>0.05）。DM組與正常對照組比較，DM組大鼠的腦皮質中P-選擇素陽性神經元表達的光密度值明顯升高，差異具有統計學意義 （P<0.05）。DM寒潮組與DM非寒潮組比較，DM寒潮組的大鼠腦皮質中P-選擇素陽性神經元表達的光密度值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。（見圖 5、圖 6）。

圖5 各組大鼠腦皮質中P-Selectin的表達變化

圖6 各組大鼠腦皮質中P-選擇素光密度值比較

3 討論

研究表明寒冷是腦血管病發生的重要外部誘發因素。在嚴重的腦血管病變基礎上，寒潮作用后更易于促發腦卒中。本研究選取寒潮作為誘因，探討腦卒中的發病機制。

細胞粘附分子是一類調節細胞與細胞間、細胞與細胞外基質間相互結合，起粘附作用的膜表面糖蛋白。具有代表性的ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素均高表達于腦血管內皮細胞，當內皮細胞受刺激后表達大量的細胞粘附分子，即使無內皮下組織暴露也可以與血小板附著。阻斷細胞粘附分子的異常表達可能抑制或消除腦卒中的發生和發展，因而細胞粘附分子在腦卒中的發生過程中具有極其重要的作用。因此本實驗以建立糖尿病大鼠模型，通過寒潮進行誘發腦卒中，探討極端氣候對腦血管病發病的影響及其機制，預期為腦血管病防治提供理論依據。

許多動物實驗研究表明：腦梗塞后ICAM-1、VCAM-1或P-選擇素均有明顯表達上調[10-14]，臨床上也有研究進一步表明：腦梗塞后腦組織中ICAM-1和血液中可溶性ICAM-1表達水平的增高[15-17]，與神經系統功能損傷密切相關。林健雯等[18]在人工寒潮促發腦卒中發病的機制研究中發現SD大鼠<220mmHg高血壓組中，寒潮亞組的腦血管內皮 ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的 mRNA表達與蛋白表達比非寒潮亞組均有升高趨勢。

本研究發現，DM組大鼠腦組織內ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素等水平明顯高于正常對照組，這提示DM對大鼠腦血管內皮功能具有損傷作用，從而導致ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的表達上調。這可能與糖代謝紊亂引起糖化血紅蛋白升高、蛋白質的非酶糖化、血小板功能異常、微循環障礙、組織缺血、缺氧等導致血管內皮細胞損傷后使ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素等分泌增加有關。對照組大鼠在寒潮后ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的表達與寒潮前相比也略有增高，但無明顯統計學差異。而DM組大鼠經歷3d人工寒潮后，腦組織內ICAM-1、VCAM-1、P-選擇素的表達均明顯高于DM非寒潮組。這提示寒潮對正常大鼠腦血管內皮影響并不明顯，而對長期患有基礎疾病 （糖尿?。┑拇笫笥绊懛浅４?，極易導致心腦血管病的發生，甚至死亡的危險。這與國內外許多文獻報道寒冷對腦卒中具有促進作用的觀點相一致。

細胞粘附分子參與寒冷促進腦卒中發生的病理過程，其作用機制可能有以下幾點：⑴促凝作用；⑵促炎作用；⑶促進興奮性氨基酸(EAA)、自由基、髓過氧化物酶(MPO)和蛋白水解酶等神經毒性物質的釋放。

本實驗研究的均是卒中前的大鼠，我們認為細胞粘附分子表達增高可能參與寒冷促使腦卒中發生的發病機制。目前也有許多在動物試驗中使用敲除細胞粘附分子[19，20]和抗細胞粘附分子抗體[21-23]對腦卒中模型進行干預，取得了一定的效果，但臨床應用尚待開拓，故還需進一步研究來證實細胞粘附分子在腦血管疾病臨床和治療方面的作用機制，為腦卒中的預防和治療提供新的思路。