回醫(yī)烙灸對大鼠腰椎間盤退變模型軟骨基質(zhì)的影響

尤 娜 ，許建峰 ，白 帥 ，林瑞珠 ，馬玉寶 ，牛子瞻 ，張彥明 ，王英絮

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏銀川750004）

腰椎間盤退變（Intervertebral disc degeneration，IDD）是腰椎間盤突出、腰椎管狹窄、慢性下腰痛等疾病的主要原因之一［1］。隨著社會人口老齡化進程的加快，IDD將成為前所未有的公共衛(wèi)生問題，輕者引起慢性腰腿痛，重者引起神經(jīng)功能障礙，甚至截癱［2］。軟骨基質(zhì)降解在椎間盤的退變病理過程中起到重要作用。特色的回醫(yī)烙灸療法不僅治療腰椎間盤突出癥療效確切，而且可以防止腰椎間盤的退變，但作用機制不明［3］。因此，本實驗采用回醫(yī)烙灸療法干預(yù)大鼠腰椎間盤退變模型，觀察腰椎間盤軟骨基質(zhì)及主要調(diào)節(jié)因子MMP-3、TIMP-1的表達，為回醫(yī)烙灸療法防治腰椎間盤退變提供理論和實驗根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 2月齡清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠 40只，雄性，體質(zhì)量（250±20）g，寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進行。動物合格證號：SCXK（寧）2014-0014。動物分籠單獨適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第5天開始造模。將SD大鼠隨機分為4組：正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組和回醫(yī)烙灸組，每組各10只。

1.1.2 藥品及試劑 Ⅱ型膠原纖維、MMP-3、TIMP-1，SABC、DBA試劑盒（武漢博士德）。氨基甲酸乙酯和4%多聚甲醛固定液購于銀川市偉博鑫生物科技有限公司。灸法所用艾絨購于寧夏醫(yī)藥公司［豫鄭食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012第1270003號］。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，大鼠稱重，術(shù)前X線片定位，模型對照組和回醫(yī)烙灸組20只SD大鼠進行造模，以20%的氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，麻醉滿意后大鼠腹部剃毛，取仰臥位，四肢橡皮筋固定，常規(guī)碘伏消毒，鋪無菌洞巾。采用旁正中切口，長大概1.5～2.0 cm，遠端超過髂嵴2～3 mm，鈍性分離腹直肌。用生理鹽水濕紗布向頭側(cè)、對側(cè)推移將腸管及腹膜，慢慢暴露腹后壁，保護好下腔靜脈、動脈和輸尿管，從脊柱附著點慢慢分離腰大肌，逐步暴露 L3/4、L4/5、L5/6、L6～S1腰間盤，采用21G微量無菌穿刺針對暴露的椎間盤行穿刺，針刺角度與椎間盤矢狀面呈60°，平行于軟骨終板進針，穿刺深度為2.3 mm，穿刺針貫穿整個纖維環(huán)全層，但不要損傷終板軟骨。穿刺成功后，取出紗布，小心整理腹腔臟器，生理鹽水沖洗腹腔，縫合腹膜層和肌層、關(guān)閉皮膚，無菌紗布覆蓋。假手術(shù)組SD大鼠腹部皮膚剃毛，常規(guī)消毒鋪巾，僅切開腹部皮膚后即縫合。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3 d每只大鼠臀部肌肉注射青霉素5萬IU抗感染治療。術(shù)后觀察步態(tài)，進食，有無大便和尿潴留，傷口滲出和感染情況。4 w后即可獲得穩(wěn)定的 IDD 模型［4］。

1.2.2 治療方法 造模4 w后開始干預(yù)，回醫(yī)烙灸組固定好大鼠，將動物的鐵器灸具輕輕置于大鼠命門到腰俞的皮膚之上，點燃灸槽內(nèi)的3 g艾絨，發(fā)熱的動物鐵器灸具可使局部皮膚發(fā)紅、輕微發(fā)泡，每周2次，每次約20 min，干預(yù)8 w后進行取材。空白對照組、假手術(shù)組和模型對照組：3組動物不予干預(yù)，正常飲食，8 w后取材。

1.2.3 軟骨取材 8 w后以空氣靜脈栓塞處死動物，完整取出 L3/4、L4/5、L5/6、L6～S1椎間盤（包括終板、髓核和纖維環(huán)），L4/5椎間盤標(biāo)本立即沖洗后置于4%甲醛溶液中固定24 h；后置于EDTA液37℃恒溫箱中脫鈣2個月，流水持續(xù)沖洗1 h，梯度乙醇依次脫水，進行二甲苯透明，浸蠟后石蠟包埋。

1.3 椎間盤蛋白多糖含量檢測

取L3/4椎間盤組織，采用分光光度法，根據(jù)吸光度值折算成濃度測定蛋白多糖含量。

1.4 免疫組化觀測Ⅱ型膠原纖維、MMP-3、TIMP-1蛋白的表達

采用免疫組化方法進行檢測，方法步驟按照各試劑盒說明進行。圖像分析處理：在400倍顯微鏡下隨機選取8個不重疊的視野，測定陽性細胞，取每張切片均值作為其測量值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，4組的軟骨細胞Ⅱ型膠原纖維、MMP-3、TIMP-1蛋白組間比較，采用One-Way ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 椎間盤蛋白多糖含量

模型對照組腰椎間盤蛋白多糖含量明顯低于正常對照組和假手術(shù)組（P＜0.05）。回醫(yī)烙灸組蛋白多糖含量高于模型對照組（P＜0.05）。回醫(yī)烙灸組蛋白多糖含量與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表 1。

表1 4組大鼠椎間盤蛋白多糖含量比較 （±s）

表1 4組大鼠椎間盤蛋白多糖含量比較 （±s）

注：與模型對照組比較，P＜0.05

組別 蛋白多糖（pg/mg)正常對照組 2.74±0.031）假手術(shù)組 2.61±0.011）模型對照組 1.03±0.02回醫(yī)烙灸組 2.23±0.031）F 2.99 P＜0.05 1）

2.2 免疫組化觀察II型膠原纖維、MMP-3、TIMP-1的表達

切片用DBA染色的陽性結(jié)果為軟骨細胞胞漿呈棕褐色或棕黃色顆粒，陰性胞漿不著色或僅有背景著色。相對于模型對照組，回醫(yī)烙灸組和正常對照組、假手術(shù)組椎間盤組織II型膠原纖維的含量較高（P＜0.05）；回醫(yī)烙灸組椎間盤組織II型膠原纖維低于假手術(shù)組（P＜0.05）。回醫(yī)烙灸組、假手術(shù)組和正常對照組椎間盤組織MMP-3陽性細胞數(shù)低于模型對照組（P＜0.05）；回醫(yī)烙灸組椎間盤組織MMP-3陽性細胞數(shù)、假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型對照組TIMP-1陽性細胞數(shù)低于回醫(yī)烙灸組、正常對照組、假手術(shù)組（P＜0.05）。回醫(yī)烙灸組TIMP-1陽性細胞數(shù)和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 4組大鼠椎間盤II型膠原纖維、MMP-3、TIMP-1表達的比較（±s）

表2 4組大鼠椎間盤II型膠原纖維、MMP-3、TIMP-1表達的比較（±s）

注：與模型對照組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05

組別 Ⅱ型膠原纖維 MMP-3 TIMP-1正常對照組 181.92±10.581） 28.75±3.311） 47.63±11.211）假手術(shù)組 183.56±13.971） 32.54±2.731） 45.69±4.741）模型對照組 78.37±9.24 136.82±6.86 32.12±4.37回醫(yī)烙灸組 152.48±7.451）2） 52.62±8.131）2） 42.34±1.051）F 3.58 4.02 3.61 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

回醫(yī)烙灸療法是回族醫(yī)藥最具民族和地區(qū)特色的療法之一，目前仍然是國內(nèi)外非常盛行的一種治療手段。烙灸療法是用烙藥或鐵器燒灼直接烙燙于病痛體表部位，使局部發(fā)紅發(fā)泡，促使機體康復(fù)的一種治療方法。回醫(yī)烙灸療法是中醫(yī)學(xué)化膿灸療法的深化，加熱后治療面積大，并且灸量可控，具有鐵制灸具傳熱均勻和迅速等優(yōu)點。我們遵循《素問·上古天真論》“腎氣平均，筋骨強勁”，《素問·脈要精微論》“腰者，腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣”及《回回藥方·針灸門》“是凡一體內(nèi)，多有惡潤凝聚以致本體，并其稟性作壞……必以火灸之，則本體病根盡去”之旨，采用具有濃郁民族特色的回醫(yī)烙灸療法治療腰椎間盤突出癥和防治腰椎間盤退變，有補腎通督、強筋健骨的臨床功能，不僅能有效地改善腰椎間盤突出癥的臨床癥狀，而且還可以防治腰椎間盤退變［5］。在回醫(yī)特色烙灸治療腰椎間盤突出癥和腰椎間盤退變良好療效的基礎(chǔ)上，進一步探討其對腰椎間盤退變的療效機制具有重要的意義。

細胞凋亡引起基質(zhì)成分失衡、代謝紊亂，導(dǎo)致蛋白多糖和膠原纖維分解，其中蛋白多糖的減少與椎間盤的退變程度成正比，I型膠原增加和II型膠原減少，進而影響了纖維的強度，從而導(dǎo)致椎間盤彈性降低，抗壓、吸收和分散負荷能力下降及退變的發(fā)生［5-7］。其中MMP-3屬于基質(zhì)分解酶類，在降解Ⅱ型膠原中起主要作用。TIMPs是MMPs活性的主要抑制劑，已發(fā)現(xiàn)的有TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TlMP-4 等 4 型［7-9］。而當(dāng)力學(xué)負荷和炎癥刺激等周圍環(huán)境發(fā)生改變時，可以誘導(dǎo)MMPs高表達，引起MMPs/TIMPs比例失衡，導(dǎo)致基質(zhì)過度分解，腰椎間盤退變發(fā)生［10-14］。

通過本實驗研究表明，回醫(yī)烙灸組椎間盤組織中Ⅱ型膠原纖維和蛋白多糖的含量高于模型對照組（P＜0.05），說明回醫(yī)烙灸療法可以減少Ⅱ型膠原纖維和蛋白多糖的降解，從而延緩了腰椎間盤的退變。回醫(yī)烙灸可能通過調(diào)節(jié)p38MAPK信號通路而減少軟骨細胞的凋亡，進一步影響MMP-3和TIMP-1的表達，減少Ⅱ型膠原纖維和蛋白多糖的降解［12］。回醫(yī)烙灸組椎間盤組織中MMP-3的表達低于模型對照組（P＜0.05），說明回醫(yī)烙灸療法可以使MMP-3蛋白表達減少。回醫(yī)烙灸組椎間盤組織中TIMP-1的表達高于模型對照組（P＜0.05），說明回醫(yī)烙灸療法可以使TIMP-1蛋白表達增加。回醫(yī)烙灸療法可能通過調(diào)節(jié)MMP-3/TIMP-1的平衡，減少軟骨基質(zhì)的降解。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)通過回醫(yī)烙灸治療，關(guān)節(jié)軟骨表面稍粗糙，裂隙表淺，軟骨細胞排列整齊，說明回醫(yī)烙灸療法具有良好的軟骨修復(fù)功能［13-15］。

本研究發(fā)現(xiàn)特色的回醫(yī)烙灸療法可以改善椎間盤終板軟骨細胞的基質(zhì)環(huán)境，從而減少軟骨細胞的凋亡，闡明回醫(yī)烙灸療法治療腰椎間盤退變的部分作用機制，為回醫(yī)烙灸防治椎間盤退變提供理論和實驗根據(jù)，為深入挖掘這一具有濃郁地方特色的療法奠定基礎(chǔ)。