黃芪糖蛋白提取方法的比較及抗氧化性研究

李 敏，薛慧清，康寶玲，高 麗，任晉宏，馮前進

（山西中醫藥大學，山西晉中030619）

黃芪味甘，性微溫，歸脾肺經，具有補氣健脾、利水消腫、益衛固表、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效［1］。大量研究表明，黃芪中的有效成分具有增強機體免疫力、保肝、降壓、抗衰老等功能。本課題組在前期研究中發現黃芪中的糖蛋白成分具有免疫抑制作用［2-6］，蛋白類成分具有抗氧化性［7］，并對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的治療有良好效果［8-9］。目前，從中藥中提取出很多具有抗氧化活性的物質［10-18］，這些物質具有較強的抗氧化性，可以清除人體內大量對人體不利的自由基，可以保護機體免受這些自由基的損害。糖蛋白是一類由糖類同多肽或蛋白質以共價鍵連接而形成的結合蛋白，許多中草藥、營養價值較高的菌體和藻類及一些大宗作物中所含糖蛋白均具有顯著的藥用功效和保健功能。本文通過對糖蛋白中所含的蛋白含量和糖含量的測定，并采用BioSpectrum凝膠成像系統SDS-PAGE凝膠圖中的糖蛋白條帶進行分析，優選出黃芪糖蛋白最佳提取方法，并檢測其還原能力、清除DPPH能力、清除超氧陰離子自由基能力、清除羥基自由基能力等抗氧化活性，為黃芪糖蛋白后期活性方面研究奠定一定的基礎，以期為發現一種良好的抗氧化劑提供依據。

1 儀器與試藥

SpectraMax 190型酶標儀（美國MD公司），BIO-RAD3000型電泳系統（美國Bio-Rad公司），BioSpectrum凝膠成像系統（美國UVP公司），HL-200型高速多功能粉碎機（上海塞耐機械有限公司）；黃芪購自山西渾源黃芪種植基地，經山西中醫藥大學裴香萍教授鑒定為蒙古黃芪（Astragalus membranaceus var.Mongholicus）的干燥根，憑證標本保存于該室；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺、考馬斯亮藍R-250、甘氨酸、溴酚蘭、三羥甲基甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、BCA蛋白質定量試劑盒（均購自博士德生物公司），非預染中低分子量標準蛋白Marker（美國Thermo公司），H2O為去離子水。

2 方法與結果

2.1 原料預處理

將黃芪洗凈，50℃烘干，低溫粉碎，過2號篩，粉末待用。

2.2 提取樣品［19-21］

2.2.1 醇提取法 稱取黃芪粉10.0 g于燒杯中，加入70%乙醇100 mL，攪拌混勻，于4℃靜置2 h，過濾，濾液加（NH4）2SO4至飽和，于4℃靜置12 h，5 000 r/min冷凍離心5 min，取沉淀，用H2O定容至20 mL，加 1/5 量的 sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），攪拌20 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，取上層液，重復2次，直至中間無變性蛋白，棄下層氯仿，合并上層液至透析袋，透析，即黃芪糖蛋白液。

2.2.2 水提取法 稱取黃芪粉末10.0 g于燒杯中，加100 mL H2O，攪拌混勻，55℃水浴浸提1 h，過濾，棄濾渣，濾液中緩慢加（NH4）2SO4至過飽和，4℃，靜置 12 h，5000 r/min冷凍離心 5 min，取沉淀，H2O定容至20 mL，加1/5量的sevage試劑，方法同上。

2.2.3 堿提酸沉法 稱取黃芪粉末10.0 g于燒杯中，加100 mL H2O，攪拌混勻，用1 mol/L pH 9的NaOH溶液調pH至9.0，55℃水浴浸提1 h，過濾，濾液用1 mol/L的HCl調pH至4.2，4℃，靜置12 h，5 000 r/min冷凍離心 5 min，取沉淀，H2O 定容至20 mL，加1/5量的sevage試劑，方法同上。

2.2.4 緩沖液提取法 稱取黃芪粉末10.0 g于燒杯中，加100 mL Tris-HCl緩沖液，攪拌混勻，55℃水浴浸提1 h，過濾，濾液濃縮至20 mL，加1/5量的sevage試劑，方法同上。

2.3 含量測定

將不同方法提取的糖蛋白樣品分別加入96孔板中，通過BCA試劑盒，用酶標儀測定562 nm，標準品和樣品的吸光度，并作標準品濃度曲線以此計算樣品的濃度。通過葡萄糖測定試劑盒，用酶標儀測定505 nm，樣品中糖的含量。

不同方法提取的糖蛋白中蛋白含量、糖含量測定結果如圖1、圖2所示，緩沖液提取的黃芪糖蛋白的蛋白含量和糖含量最高，分別為6.8 mg/mL和21.88 mmol/L，水提取法得到的黃芪糖蛋白蛋白和糖含量較高，分別為5.89 mg/mL和17.5 mmol/L，堿提酸沉法得到的黃芪糖蛋白蛋白和糖含量較低，為1.45 mg/mL和3.65mmol/L，醇提取法得到的黃芪糖蛋白蛋白和糖含量最低為0.7 mg/mL和1.56 mmol/L。因此，Tris-HCl緩沖液提取法為最好的提取方法。

圖1 不同提取法所得糖蛋白中蛋白的含量

圖2 不同方法提取的糖蛋白中糖的含量

2.4 凝膠制備與電泳

濃縮膠為5%，分離膠為12%，樣品上樣量為20 μL，Marker上樣量為 7 μL。采用垂直板電泳，條件為濃縮膠區恒定電壓120 V，分離膠區恒定電壓為180 V。考馬斯亮藍R250染色0.5 h，脫色液脫色至膠板條帶清晰。采用BioSpectrum凝膠成像系統對凝膠進行拍照，并對電泳條帶進行分析，結果見圖3。

圖3 不同方法提取的黃芪糖蛋白的SDS-PAGE電泳圖

由圖3可見，不同方法提取的糖蛋白的SDS-PAGE圖譜具有多條共有條帶，但是不同方法在某些條帶的有無、強弱等方面有所差異。緩沖液提取法所得的2號和水提法所得的3號電泳譜帶數目最多，主要集中在35～25 kD和18.4～14.4 kD分子量范圍之間，2號譜帶顏色較深，說明蛋白含量比3號高。堿提酸沉法所得的1號和醇提法4號電泳譜帶數目較少，而且條帶顏色較淺，說明蛋白含量較低，種類較少。電泳檢測和含量測定的結果相吻合，緩沖液提取法提取的糖蛋白蛋白含量和糖含量為最高，因此緩沖液提取法為提取黃芪糖蛋白的最佳方法。

2.5 抗氧化性測定

2.5.1 還原能力 取緩沖液法提取的黃芪糖蛋白，配成濃度為 1 mg/mL，2 mg/mL，3 mg/mL，4 mg/mL，5 mg/mL溶液，各取2 mL，加2 mL 0.2 mol/L PBS緩沖液，2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴20 min。再加2 mL 10%三氯乙酸溶液，震蕩混勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 mL，再加2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，50℃水浴10 min，在波長700 nm處測定吸光度值（Bs），以 Tris-HCl緩沖液作空白對照（Bb），維生素C為陽性對照。

圖4 黃芪糖蛋白還原能力

隨著濃度的增加，黃芪糖蛋白與維生素C的還原能力逐漸增大，當濃度為5mg/mL時，黃芪糖蛋白的還原能力為維生素C的1/2。結果見圖4。還原力是檢驗樣品是否具有良好的供電子能力，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，因此認為它與抗氧化活力緊密相關，還原力越大，抗氧化性越強［22］。

2.5.2 清除DPPH的能力 取不同濃度的黃芪糖蛋白液各 0.5 mL，加入 2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液，室溫下避光反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度值（As），以DPPH溶液作空白測（Ac），糖蛋白對 DPPH 清除率 CR（%）=（1-As/Ac）×100%，維生素C為陽性對照。

DPPH是一種穩定的自由基，當自由基清除劑加入到DPPH溶液中時，孤對電子被配對，深紫色的DPPH自由基將被還原成黃色的DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與自由基清除劑的濃度呈正相關，且與所接受的電子數量呈定量關系，因而可以通過吸光度的變化進行對多酚清除自由基能力的定量分析［23-26］。結果見圖5。

圖5 黃芪糖蛋白清除DPPH自由基能力

結果如圖5所示，隨著濃度的升高，黃芪糖蛋白清除DPPH的能力逐漸增大，清除率與濃度呈正相關，當濃度為5 mg/mL時，清除率為65%，維生素C清除DPPH的能力保持在87%，說明黃芪糖蛋白具有一定的清除DPPH能力。

2.5.3 清除羥自由基能力 取不同濃度的黃芪糖蛋白液各1 mL，加2 mL 0.15 mol/L PBS緩沖液，1.0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液，1 mL 0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液，1 mL 0.1%H2O2，混勻，37℃水浴20 min，在波長536 nm處測定吸光值（Bs）。以Tris-HCl緩沖液作為空白對照。羥基自由基清除率CR（%）=（Bs-Bc）/（Bb-Bc）×100%。（Bb表示同體積的Tris-HCl緩沖液代替樣品吸光度，Bc表示同體積Tris-HCl緩沖液代替樣品和雙氧水的吸光度），維生素C為陽性對照。

在活性氧自由基中，羥自由基最活躍，也是活性最強的活性氧自由基，可以通過電子轉移、加成以及脫氫等方式與生物體內的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化損傷，使細胞壞死或突變，羥基自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬等有關。實驗結果隨著濃度的增加，黃芪糖蛋白清除羥自由基的能力逐漸增大，當濃度為5 mg/mL時，清除羥自由基能力為60%，維生素C的濃度為1mg/mL時的清除率為100%，相比而言黃芪糖蛋白清除羥自由基的能力較維生素C弱。結果見圖6。

圖6 清除羥自由基能力

2.5.4 清除超氧陰離子自由基能力 取不同濃度的黃芪糖蛋白液各0.1 mL，加2.7 mL 0.1 mol/L Tris溶液，25℃水浴10 min，再加0.2 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液，迅速混勻，每隔30 s在波長325 nm處測吸光值（A），5 min結束，做吸光度隨時間變化的回歸方程，鄰苯三酚自氧化速率（Vs）為斜率，Tris-HCl緩沖液為空白測得斜率為（Vc）。對超氧陰離子自由基的抑制率 CR（%）=（Vc-Vs）/Vc×100%，維生素C為陽性對照。

超氧陰離子自由基不僅具有重要的生物功能，也與多種疾病有密切的聯系。它是基態氧接受1個電子后形成的第1個氧自由基，可經過一系列反應生成其他氧自由基，因此，作為抗氧化活性指標具有特別重要的意義［27］。黃芪糖蛋白隨著濃度的增加，清除超氧陰離子自由基的能力逐漸增大，當濃度為3 mg/mL時，清除超氧陰離子自由基的能力達到90%，接近維生素C的清除率，說明黃芪糖蛋白具有較強的清除超氧陰離子自由基的能力。結果見圖7。

圖7 清除超氧陰離子自由基能力

3 討 論

植物糖蛋白是繼多糖之后食品功能性成分開發和研究的熱點，這類成分的一些特性有益于人體健康，在生化、醫藥，食品等領域具有多方面的用途［1］。黃芪是我國常用中藥，本文通過不同的方法從黃芪中提取糖蛋白，采用SDS-PAGE電泳、糖含量和蛋白含量的測定對4種黃芪糖蛋白提取方法進行了比較篩選，得出緩沖液提取的糖蛋白中蛋白和糖的含量最高，電泳譜帶多，辨識率高且該方法蛋白電泳條帶分離度較好，更適合用于黃芪糖蛋白的研究。

抗氧化活性是保健食品27種保健功能中的一種，抗氧化活性就是能有效清除體內有害自由基、防止脂質過氧化，防止自由基對生物大分子的氧化損傷，保證細胞結構與功能的正常。有研究表明，人體代謝產生的自由基與多種疾病密切相關，由于人工合成的抗氧化劑對人體存在潛在的毒副作用，因此，應用一些安全性高的天然抗氧化劑來清除體內自由基成為研究的熱點［28］。我國中藥資源豐富，這些中藥資源屬于天然產物，具有比較高的安全性，中藥中的抗氧化性成分很多，例如，黃酮類、多酚類、多糖類、蛋白類等，這些都屬于植物類抗氧化性成分。目前，也越來越多地關注從中藥中提取分離和純化抗氧化活性成分，這些研究為開發源自于植物的抗氧劑奠定了良好的基礎。本文通過測定黃芪糖蛋白的還原能力、清除超氧陰離子、羥自由基及DPPH自由基的能力考察了體外抗氧化活性，結果表明黃芪糖蛋白具有一定的抗氧化活性，糖蛋白對自由基的清除率與濃度呈正相關，清除率為60%～90%，其中清除超氧陰離子活性清除率到90%，接近維生素C的活性。實驗結果與王麗華等［16］從中藥丹參中提取出糖蛋白也具有抗氧化活性，清除率為15.3%～86.9%，且量效關系明顯，相類似。黃芪除了具有“補氣升陽，益固表衛，利水消腫，托瘡生肌”之功效外，還可用作抗氧化劑，清除及防止人體內氧自由基的危害，其提取物糖蛋白有可能成為一種新型的抗氧化劑或食品添加劑。