唐山工人醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯肺炎克雷白菌耐藥表型分析

郭彥言等

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2017.26.1

摘要 目的：檢測耐碳青霉烯肺炎克雷白菌KPC酶及金屬酶，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法：選擇耐碳青霉烯肺炎克雷白菌35株，采用改良Hodge試驗(yàn)檢測KPC酶，采用紙片協(xié)同法檢測金屬酶。結(jié)果：35株肺炎克雷白菌改良Hodge試驗(yàn)均呈陽性；其不但對碳青霉烯類抗生素耐藥，且對大部分β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥（耐藥率100%），對喹諾酮類抗生素耐藥（耐藥率>70%）；對少數(shù)抗生素，如頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率較低。2株同時(shí)產(chǎn)KPC及MBL的肺炎克雷白菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，其對所檢測抗生素耐藥率均100%。結(jié)論：耐碳青霉烯肺炎克雷白菌既能將耐藥基因傳遞給其他細(xì)菌，同時(shí)又能夠接受其他細(xì)菌的耐藥基因，使該菌更易產(chǎn)生耐藥性。

關(guān)鍵詞 耐碳青霉烯；肺炎克雷白菌；KPC酶；金屬酶

肺炎克雷白菌是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，廣泛分布于人體的皮膚表面、工作臺面等處。近年來，隨著廣譜抗生素的大量使用，臨床上分離的多重耐藥的肺炎克雷白菌不斷增加。碳青霉烯類抗生素是治療腸桿菌科細(xì)菌感染的最有效藥物，然而隨著使用的增多，陸續(xù)出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥的菌株，不利于臨床抗感染治療。

目前國內(nèi)外研究表明，肺炎克雷白菌對碳青霉烯類抗生素的敏感性降低可能與細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶和金屬酶有關(guān)。為了解我院ICU耐碳青霉烯肺炎克雷白菌的流行表型，本研究以ICU近3年分離耐碳青霉烯肺炎克雷白菌為對象，檢測菌株KPC酶及金屬酶的情況，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

資料與方法

菌株來源：本研究檢測菌株為唐山市工人醫(yī)院檢驗(yàn)科于2014年1-12月在ICU住院患者標(biāo)本中分離出對亞胺培南及美洛培南耐藥的肺炎克雷白菌菌株35株。

菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)：從臨床分離的細(xì)菌分純過夜培養(yǎng)后進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)及革蘭染色，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在西門Microscan96plus全自動微生物分析儀上進(jìn)行菌種鑒定。藥敏試驗(yàn)采用K-B法。藥敏紙片阿莫西林，克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢哌酮，舒巴坦、阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、米諾環(huán)素、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、復(fù)方新諾明均為OXOID產(chǎn)品，嚴(yán)格依照操作規(guī)程進(jìn)行操作。判斷標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI2013年推薦方法。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷白菌ATCC 70063。

KPC酶檢測：采用改良Hodge試驗(yàn)。用大腸埃希菌ATCC 25922以生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)菌懸液，1：10稀釋，按常規(guī)K-B法程序接種MH平板，干燥5 min，在中央放置美羅培南（10μg）紙片1張，使用10μL接種環(huán)挑取在中國蘭平板生長的3～5個(gè)試驗(yàn)菌落，從紙片邊緣向外劃直線接種。35℃孵育24h后，檢查在抑菌環(huán)與實(shí)驗(yàn)菌株交叉處是否出現(xiàn)增強(qiáng)生長。

金屬酶的檢測：采用紙片協(xié)同法，將待測菌制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木海脽o菌棉簽蘸取菌液在M-H瓊脂平板上均勻涂布，反復(fù)4次，每次90。，邊緣也涂布1周，將2張亞胺培南（IPN）紙片貼在平皿上，間距2 cm，其中一張上加入5μL EDTA，含EDTA的亞胺培南紙片的抑菌圈直徑較亞胺培南紙片增加6 cm為陽性，表示此菌株產(chǎn)金屬酶。

結(jié)果

35例耐碳青霉烯肺炎克雷白菌對抗生素的耐藥率，見表1。

KPC酶檢測結(jié)果：35株菌株中改良Hodge實(shí)驗(yàn)陰性O(shè)株，陽性35株，陽性率100%。

金屬酶檢測結(jié)果：35例耐碳青霉烯肺炎克雷白菌中檢測出2株金屬酶陽性，其對所檢測抗生素耐藥率均100%。

討論

隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，耐亞胺培南的肺炎克雷白菌的報(bào)道逐年增加，美國在幾年前已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷白菌，并曾在局部造成暴發(fā)流行。KPC酶是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型碳青霉烯酶，能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物，成為細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制。

本研究顯示，35株肺炎克雷白菌改良Hodge試驗(yàn)均呈陽性，其不但對碳青霉烯類抗生素耐藥，對大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率達(dá)100%，對喹諾酮類抗生素耐藥率>70%，對少數(shù)抗生素，如頭孢哌酮，舒巴坦、阿米卡星、米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明耐藥率較低，可能與我院大量使用碳青霉烯類抗生素治療感染有關(guān)。產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷白菌主要存在于被污染的醫(yī)療器械、醫(yī)務(wù)人員的雙手，可通過質(zhì)粒介導(dǎo)傳播，引起嚴(yán)重醫(yī)院感染。

金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBL）是一組依賴少數(shù)金屬離子（主要為Zn²⁺）的存在而發(fā)揮催化活性的酶類，它具有廣泛水解（包括碳青霉烯類在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗生素）的能力，而且對常用的酶抑制劑，如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦敏感性差；產(chǎn)酶基因大多由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子等可移動遺傳元件介導(dǎo)，易于傳播。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。2株同時(shí)產(chǎn)KPC酶及MBL的肺炎克雷白菌不僅對碳青霉烯類抗生素耐藥，其對所檢測抗生素耐藥率均100%。由于條件有限，本研究中2株產(chǎn)金屬鎂菌株的具體基因型以及是否存在其他耐藥基因還有待進(jìn)一步研究。

總之，耐碳青霉烯肺炎克雷白菌的暴發(fā)流行正逐年增多，其既能夠?qū)⒛退幓騻鬟f給其他細(xì)菌，同時(shí)又能夠接受其他細(xì)菌的耐藥基因，使該菌更易產(chǎn)生耐藥性，迅速地成為少數(shù)幾種最為難治的醫(yī)院條件致病菌之一。這給醫(yī)務(wù)工作者再次敲響警鐘，臨床醫(yī)生要注意合理用藥，而實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)加強(qiáng)耐藥菌的監(jiān)測以及對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行篩選，及時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶菌株。鑒于廣泛耐藥菌株感染的治療難度，我們應(yīng)將對策放在預(yù)防上，配合醫(yī)院感控部門，做好感染控制工作，防止產(chǎn)酶菌的暴發(fā)流行。endprint