藍(lán)雪花組培快繁無菌體系建立的研究

宗樹斌 王永平 任煥煥

摘 要：以帶腋芽莖段為外植體，通過外植體消毒試驗(yàn)和培養(yǎng)基、激素種類及激素濃度正交試驗(yàn)對(duì)藍(lán)雪花組培快繁無菌體系的建立進(jìn)行研究。結(jié)果表明：外植體消毒用10%次氯酸鈉滅菌8min，或用0.1%升汞滅菌6min，效果最佳，滅菌充分，致死率低。激素種類因素是影響誘導(dǎo)率的主導(dǎo)因素，試驗(yàn)最佳的組合是WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT），誘導(dǎo)率達(dá)到92.3%。

關(guān)鍵詞：藍(lán)雪花;外植體;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2018）24-0016-4

Abstract：Stem segments with axillary buds were used as explants to study the establishment of the rapid propagation aseptic system of Plumbago auriculata through explant disinfection experiment ，and? orthogonal experiment of culture medium，hormone types and hormone concentration. The results showed that the best sterilization time of explants with 10% sodium hypochlorite was 8 minutes，the best sterilization time was 6 minutes with 0.1% liter mercury，the best sterilization time was filled with sterilization and mortality rate is low. Orthogonal test showed that hormone type was the dominant factor affecting the induction rate，and the best combination was WPM medium + 0.4mg/L zeatin （ZT） treatment，the induction rate reached 92.3%.

Key words：Plumbago auriculata;Explant;Tissue Culture

藍(lán)雪花（Plumbago auriculata）原產(chǎn)南非，又名藍(lán)花丹、藍(lán)雪丹、藍(lán)花磯松、藍(lán)茉莉等，為白花丹科（藍(lán)雪科）白花丹屬多年生常綠灌木。藍(lán)雪花長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)健，耐熱，較耐高溫高濕，病蟲害少，管理簡(jiǎn)單，觀賞期長(zhǎng)。葉色翠綠，花色淡雅，炎熱的夏季給人以清涼感覺，可盆栽點(diǎn)綴居室、陽臺(tái);成熟植株枝條懸垂，適宜大型容器組合盆栽，可用于場(chǎng)館周邊道路、立交橋等主要路段的綠化美化，可地栽林緣種植或點(diǎn)綴草坪[1]。藍(lán)雪花花期正值少花的夏季，而且是自然界少有的藍(lán)色花，受到園林工作者青睞[2]。藍(lán)雪花作為一種新優(yōu)觀花花卉被引種栽培，在一些重要綠化地段被推廣應(yīng)用，發(fā)揮了很好的景觀效果，其種苗需求量逐年遞增，市場(chǎng)潛力巨大。另外，藍(lán)雪花含有大量白花丹素[3-4]，對(duì)風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛、血瘀經(jīng)閉、跌打損傷、腫毒惡瘡以及疥癬均具有較好的治療作用[5]，兼具較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[6]。

目前國內(nèi)對(duì)藍(lán)雪花的研究剛剛起步，主要集中在其觀賞特性、引種栽培、生物學(xué)特性等方面[7]。對(duì)藍(lán)雪花的栽培管理和繁殖技術(shù)還主要只是一些經(jīng)驗(yàn)性的總結(jié)，在學(xué)術(shù)方面的系統(tǒng)研究則比較少[8]。藍(lán)雪花的繁育類型為異交型，開花強(qiáng)度不高，不利于吸引昆蟲，不利于生殖成功，加之藍(lán)雪花是典型的花柱異型植物，且具有自交不親和性，故缺少傳粉者則其結(jié)實(shí)率很低[9]。且其種子價(jià)格較為昂貴，擴(kuò)繁系數(shù)低，造成目前傳統(tǒng)繁殖方式已無法滿足藍(lán)雪花的應(yīng)用需求。對(duì)藍(lán)雪花無性繁殖技術(shù)的研究主要在于扦插繁殖技術(shù)[10，11]。組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)可以克服傳統(tǒng)繁殖方法的不足，繁殖系數(shù)大、速度快、保持優(yōu)良性狀，特別適合工廠化繁育等。因此，對(duì)藍(lán)雪花開展組織培養(yǎng)研究，建立無菌體系，是藍(lán)雪花組培工廠化繁育技術(shù)體系的基礎(chǔ)，同時(shí)也為藍(lán)雪花利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行遺傳育種及有用物質(zhì)的制備提取奠定基礎(chǔ)，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 以江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院玻璃溫室盆栽培育的2年生藍(lán)雪花為母株，采集生長(zhǎng)健壯、發(fā)育充實(shí)、無病蟲害的當(dāng)年生枝條，在枝條的中上段，去掉葉片，剪取帶腋芽的莖段為藍(lán)雪花組織培養(yǎng)的外植體。

1.2 試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院風(fēng)景園林學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行。實(shí)訓(xùn)基地有現(xiàn)代化的玻璃溫室2700m2和設(shè)備齊全的組培室300m2，基地常年進(jìn)行多種觀賞植物的引種、栽培繁育工作，能夠?yàn)樵囼?yàn)提供充足良好的條件。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體消毒方法 把剪取好的帶腋芽的莖段放入燒杯，蒙上1層紗布，在流水下沖洗30min，拿到接種室無菌操作臺(tái)上，先用75%酒精消毒60s，倒掉酒精，用無菌水沖洗1遍，然后按照表1的要求各處理采用不同的滅菌劑及滅菌時(shí)間進(jìn)行消毒，最后再用無菌水沖洗3～5遍，外植體消毒完成。在無菌操作臺(tái)上，用消過毒的剪刀和鑷子對(duì)外植體進(jìn)一步剪切，使外植體腋芽上端保留0.5～1cm長(zhǎng)度，腋芽下端保留0.5～1cm長(zhǎng)度，把剪切好的外植體接種到MS培養(yǎng)基的試管內(nèi)，每個(gè)試管接種1個(gè)外植體，每處理接種30支試管，試驗(yàn)重復(fù)3次。放在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，注意觀察記錄接種苗的污染情況、成活情況及致死情況。試管內(nèi)染菌既為污染，試管內(nèi)沒有菌且腋芽萌動(dòng)既為成活，試管內(nèi)沒菌但腋芽沒有萌動(dòng)既為致死。30d后統(tǒng)計(jì)計(jì)算各處理的污染率、成活率、致死率，分析得出最佳的外植體消毒方法。

1.3.2 培養(yǎng)基及激素選擇的正交試驗(yàn) 采用1.3.1研究得出的方法進(jìn)行外植體消毒，對(duì)藍(lán)雪花初代培養(yǎng)無菌體系的建立進(jìn)行初代培養(yǎng)基及激素濃度選擇的進(jìn)一步研究試驗(yàn)，把培養(yǎng)基、激素種類、激素濃度作為3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，因素水平見表2，采用正交設(shè)計(jì)表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)表見表3。

按照正交試驗(yàn)表，每處理接種10個(gè)培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種10個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。把培養(yǎng)瓶放置在溫度（25±1）℃、光照強(qiáng)度36～54μmol/m2·s，光周期（12h光照/12h黑暗）條件下進(jìn)行培養(yǎng)。觀察記錄外植體的分化誘導(dǎo)情況，60d后統(tǒng)計(jì)記錄各處理的有效誘導(dǎo)苗數(shù)（有效誘導(dǎo)苗是指誘導(dǎo)芽苗高度2cm以上，至少含有1個(gè)莖節(jié)），計(jì)算各處理的誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率（%）=（有效誘導(dǎo)苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100

對(duì)各處理的誘導(dǎo)率利用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行極差分析、方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒方法 觀察記錄各處理外植體的生長(zhǎng)情況，記錄下污染的試管數(shù)、成活的試管數(shù)以及致死的試管數(shù)，算出各處理的平均污染率、平均成活率和平均致死率，結(jié)果如表4所示。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

試驗(yàn)采用了10%次氯酸鈉和0.1%升汞2種滅菌劑進(jìn)行不同時(shí)間處理，根據(jù)表4結(jié)果，分別對(duì)10%次氯酸鈉和0.1%升汞不同滅菌時(shí)間處理的滅菌效果作直觀分析，如圖1、2所示。

由圖1和圖2可以看出，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸降低，成活率逐漸升高，而隨著滅菌時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，開始出現(xiàn)致死率，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)致死率逐漸提高，而成活率則相應(yīng)降低。這是因?yàn)闇缇鷦┰谝欢〞r(shí)間內(nèi)可以殺死細(xì)菌，但時(shí)間過長(zhǎng)滅菌劑同樣會(huì)對(duì)外植體有傷害作用使外植體致死。因此，在組培無菌體系建立外植體消毒時(shí)，均需準(zhǔn)確找到1個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使得外植體能夠滅菌充分，而又不會(huì)被致死。從圖1可以看出，利用10%次氯酸鈉滅菌劑消毒時(shí)滅菌時(shí)間8min為最佳，滅菌充分，而致死率很低;從圖2可以看出，利用0.1%升汞進(jìn)行消毒時(shí)滅菌6min為最佳。同時(shí)，比較圖1和圖2，從成活率和致死率的走勢(shì)可以判斷，0.1%升汞相對(duì)10%次氯酸鈉更為敏感，在進(jìn)行滅菌消毒時(shí)對(duì)時(shí)間的要求更為嚴(yán)格。

2.2 培養(yǎng)基及激素選擇 統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基及激素濃度正交試驗(yàn)各處理的有效誘導(dǎo)苗數(shù)，算出各重復(fù)處理的誘導(dǎo)率，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

由表5可知，平均誘導(dǎo)率最高的處理是處理9達(dá)到了92.3%，即誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果最佳的組合WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT）。

2.2.1 極差分析 對(duì)表5正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)作極差分析（見表6）。通過極差分析得出最優(yōu)組合是WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT），這與試驗(yàn)結(jié)果是一致的。各因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響大小依次為激素種類>激素濃度>培養(yǎng)基。

2.2.2 方差分析 對(duì)表5正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)作方差分析。由表7可以看出，各因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響，培養(yǎng)基和激素濃度顯著性均未小于0.05，影響均不顯著，而激素種類顯著性小于0.01，影響極顯著。對(duì)激素種類作進(jìn)一步的多重比較分析。

2.2.3 多重比較 對(duì)激素種類對(duì)誘導(dǎo)率的影響進(jìn)行用LSD檢驗(yàn)多重比較。由表8可知，激素種類因素中，誘導(dǎo)率最高的是玉米素（ZT），平均誘導(dǎo)率達(dá)到91.33%;其次是6-BA，平均誘導(dǎo)率81.33%，與玉米素的差異達(dá)到極顯著水平;誘導(dǎo)率最低的是IAA，平均誘導(dǎo)率為71.56%，與6-BA的差異也達(dá)到了極顯著水平。

3 結(jié)論與討論

利用帶腋芽莖段為外植體進(jìn)行藍(lán)雪花組織培養(yǎng)，外植體消毒可以先用75%酒精滅菌60s后，再用10%次氯酸鈉滅菌8min，或者用0.1%升汞滅菌6min，均能起到很好的消毒效果，滅菌比較充分，且致死率低。0.1%升汞滅菌劑相對(duì)10%次氯酸鈉滅菌劑較為敏感，對(duì)滅菌時(shí)間要求更嚴(yán)。其他常見滅菌劑如過氧化氫、硝酸銀、溴水等滅菌時(shí)間需要作具體的試驗(yàn)研究。

通過對(duì)培養(yǎng)基、激素種類、激素濃度3因素正交試驗(yàn)，研究了藍(lán)雪花組培初代培養(yǎng)無菌體系建立的條件。3因素中激素種類對(duì)誘導(dǎo)率的影響最大，其次是激素濃度，最后是培養(yǎng)基。方差分析表明，激素種類對(duì)誘導(dǎo)率的影響極顯著，激素濃度和培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)率的影響均不顯著。進(jìn)一步的多重比較表明，玉米素是最佳的激素處理，其次是6-BA，最后是IAA，3者之間的差異均達(dá)到了極顯著水平。綜合比較得到了最佳組合是WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT）處理，最高誘導(dǎo)率達(dá)到92.3%。

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（責(zé)編：徐世紅）