ABCB1基因C3435T 位點多態性與新疆維吾爾族人群癲癇及耐藥性的關系研究

高華，陳明，裴靜，陳方方，潘燕，孔祥鋒

癲癇是一種神經系統慢性疾病，具有較高的猝死風險，其主要病理機制為腦內神經元異常放電導致腦功能短暫性障礙［1］。據流行病學統計顯示，全球約有7 000萬例癲癇患者，以中低收入國家為主，兒童、青少年多見［2-3］。在我國，癲癇患者有900萬例左右，且每年有1‰～2‰的患者因癲癇猝死［4-5］。目前癲癇的治療仍以藥物治療為主，大部分患者服用抗癲癇藥物后效果良好，但仍有20%～30%的患者對抗癲癇藥物不敏感［6］，被稱為耐藥性癲癇［7］。耐藥性癲癇不僅損傷患者中樞神經系統的功能和結構，增加患者骨折或骨質疏松發生風險，長期癲癇還會引起患者精神心理問題，如焦慮、抑郁、認知功能下降等，在一定程度上增加患者自殺、意外事故死亡風險［8］。

有研究顯示，遺傳基因多態性可能參與抗癲癇藥物進入機體后的反應過程［7］。ABCB1基因（也稱為多藥耐藥蛋白1）編碼的膜轉運體蛋白可對抗癲癇藥物在體內分布以及腸內吸收過程產生一定影響，P糖蛋白（P-gp）是第1個被發現的人類ABCB蛋白［9-11］，其水平變化與ABCB1基因C3435T位點多態性有關［12］。新疆地區民族分布具有一定特點，形成了與地域、民族相關的疾病，本研究旨在探討ABCB1基因C3435T位點多態性與新疆維吾爾族人群癲癇及耐藥性的關系，為新疆維吾爾族癲癇患者的治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：（1）年齡 ＞ 14歲；（2）至少有2次間隔24 h以上、發作明確的非誘發性癲癇樣發作；（3）行腦電圖（EEG）、顱腦CT或核磁共振成像（MRI）檢查排除進行性中樞神經系統疾病和占位性病變者。排除標準：（1）有癲癇或高熱驚厥病史；（2）無癲癇家族史。

1.2 研究對象 選取2017年新疆醫科大學第五附屬醫院收治的住院或門診維吾爾族癲癇患者98例作為癲癇組，其中耐藥性癲癇患者38例，非耐藥性癲癇患者60例，耐藥性癲癇的診斷參照2010年國際抗癲癇聯盟制定的耐藥性癲癇診斷標準［13］；另選取同期在本院體檢健康的維吾爾族志愿者100例作為對照組。癲癇組患者中男50例，女48例；年齡18～77歲，平均年齡（41.3±12.8）歲。對照組受試者中男50例，女50例；年齡2～67歲，平均年齡（45.8±10.1）歲。對照組與癲癇組受試者性別（χ2=0.021）、年齡（t=3.368）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。耐藥性癲癇患者中男20例，女18例；年齡19～75歲，平均年齡（43.3±15.1）歲。非耐藥性癲癇患者中男32例，女28例；年齡18～77歲，平均年齡（40.0±11.0）歲。耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者性別（χ2=0.064）、年齡（t=2.683）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經新疆醫科大學第五附屬醫院醫學倫理委員會審核通過，所有受試者簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 采取兩組受試者外周靜脈血2 ml，采用天根生化科技（北京）有限公司DNA提取試劑盒（天根基離心柱型）進行DNA的提取，嚴格按照說明書進行操作。

1.3.2 基因多態性檢測 （1）引物設計：ABCB1基因C3435T位點的引物設計由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ABCB1基因C3435T位點的引物序列為 F：5'-GTTTTCAGCTGCTTGATGGCA-3'，R：5'-AAGGGTGTGATTTGGTTGCT-3'。（2）聚合酶鏈式反應（PCR）體系：樣本 DNA 2 μl，dNTP 200 μmol，MgCl21.5 mmol， 上 下 游 引 物 各 1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 U，ddH2O 8.5 μl，終體積為 25 μl。（3）PCR 擴增反應條件：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性 35 s，53 ℃退火 35 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環；最后 72 ℃延伸10 min。（4）選取5 μl PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中180 V，電泳15 min觀察條帶。（4）選取10 μl PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行直接測序并與ABCB1基因C3435T位點的基因標準序列進行比對。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。遺傳平衡檢驗采用Hardy-Weinberg平衡檢驗；計量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 癲癇組和對照組受試者ABCB1基因C3435T位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2值分別為3.111、1.601；P值分別為0.078、0.996）。

2.2 PCR擴增產物及直接測序分析 ABCB1基因C3435T位點的PCR擴增產物與理論值基本一致，見圖1。癲癇組和對照組受試者ABCB1基因C3435T位點經直接測序后均存在CC、CT、TT 3種基因分型。

2.3 癲癇組和對照組受試者ABCB1基因C3435T位點的基因型和等位基因分布頻率 癲癇組和對照組受試者ABCB1基因C3435T位點的基因型、等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

表1 癲癇組與對照組受試者ABCB1基因C3435T位點基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of genotypes and allele frequency of ABCB1 gene C3435T locus between epilepsy group and control group

圖1 ABCB1基因C3435T位點PCR擴增產物電泳圖Figure 1 The electrophoresis of PCR product of ABCB1 C3435T

2.4 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點基因型和等位基因分布頻率 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點基因型、等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allele frequency of ABCB1 gene C3435T locus in patients with drug-resistant epilepsy or not

3 討論

癲癇是常見的神經系統疾病，以藥物治療為主，但患者對抗癲癇藥物（包括卡馬西平、丙戊酸、苯巴比妥等）耐藥是影響藥物治療效果的主要原因之一。有研究顯示，癲癇患者耐藥可增加癲癇發作次數、相關并發癥和死亡風險［14-15］。目前，耐藥癲癇的發病機制尚不清楚，主要學說為轉運體假說和靶點假說［16-17］。

既往研究表明，P-gp水平及其功能均受到ABCB1基因多態性的影響［17-18］。P-gp可將細胞內部分代謝產物和部分藥物分子逆向轉運出細胞，導致細胞內藥物濃度降低。卡馬西平、苯妥英鈉等抗癲癇藥物均可作為P-gp底物，促進其水平升高［19］，進而影響藥物吸收。基于ABCB1基因C3435T位點與P-gp相關、腦內P-gp過量表達可促進抗癲癇藥物的排出及ABCB1基因被證實與部分藥物（如地高辛［20］、環孢素［21］和非索那定［22］）藥代動力學存在交互作用，推測基因多態性可能是產生癲癇耐藥的重要機制之一［23］。遺傳學研究結果顯示，ABCB1基因中常見遺傳變異與癲癇的耐藥性相關，尤其是C3435T（rs1045642）位點多態性備受關注［24-25］。單核苷酸C3435T同義突變指外顯子26的3435位點上C轉化為T，其與P-gp水平及藥物反應相關［26］。近年有關ABCB1基因C3435T位點多態性與耐藥性癲癇的相關性研究報道較多，但研究結果并不一致［27-29］。分析上述研究結果不一致的原因可能與選取的研究對象不同和疾病進展或患者自身因素導致抗癲癇藥物進入減少或耐受性增加有關［30-31］。

新疆是維吾爾族人群主要聚集地，其民俗保持了較好的同質性，且多為同民族間聯姻，遺傳穩定性較好，故本研究選取新疆維吾爾族人群為研究對象，結果顯示，癲癇組和對照組受試者ABCB1基因C3435T位點經直接測序后均存在CC、CT、TT 3種基因分型，與既往國內外關于癲癇基因分型研究的結果一致［24］。本研究結果還顯示，癲癇組和對照組受試者ABCB1基因C3435T位點基因型、等位基因分布頻率間無差異，耐藥性癲癇與非耐藥性癲癇患者ABCB1基因C3435T位點基因型、等位基因分布頻率比較無統計學差異，提示ABCB1基因C3435T位點多態性與新疆維吾爾族人群癲癇易感性及耐藥性癲癇的發生無關，與既往部分研究結果相一致［27］。

綜上所述，ABCB1基因C3435T位點多態性與新疆維吾爾族人群癲癇易感性及耐藥性癲癇的發生無關。

作者貢獻：孔祥鋒進行試驗設計；高華進行試驗實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；陳明、裴靜、陳方方進行試驗實施、評估、資料收集；潘燕進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。