免疫性血小板減少癥患者調節性B細胞數量及功能研究

張燕 壽黎紅

[摘要] 目的 研究免疫性血小板減少癥患者的調節性B細胞的數量和功能，為臨床醫師評估該類疾病患者的病情提供重要指導。 方法 以2016年10月～2018年7月本院接診的初診免疫性血小板減少癥患者40例為A組，另以本院同期接診的完全緩解免疫性血小板減少癥患者35例為B組，同時將同期接診的健康體檢者40名作為對照組，設為C組。采取流式細胞術對各組的外周血Bregs數量和白細胞介素-10表達量進行檢測，同時對其檢測結果作出分析和比較。 結果 A組的外周血Bregs數量為（3.08±0.66）%，比B組以及C組的（5.45±0.82）%、（7.82±1.03）%低，組間差異有統計學意義（P<0.05）。A組外周血Bregs中的白細胞介素-10細胞比例為（32.29±8.68）%，比B組及C組的（51.03±10.54）%、（71.88±12.28）%低，組間差異有統計學意義（P<0.05），并且B組外周血Bregs中的白細胞介素-10細胞比例比C組低，組間差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 免疫性血小板減少癥的發生與Bregs有著較為密切的關系，因此，臨床醫師可以將Bregs作為免疫性血小板減少癥的一個重要治療靶點，以進一步提高患者病情控制的效果。

[關鍵詞] 白細胞介素-10;外周血Bregs數量;免疫性血小板減少癥;調節性B細胞

[中圖分類號] R558.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）36-0025-04

[Abstract] Objective To study the number and function of regulatory B cells in patients with immune thrombocytopenia， and to provide important guidance for clinicians to assess the condition of patients with such diseases. Methods A total of 40 patients with newly diagnosed immune thrombocytopenia who were admitted in our hospital from October 2016 to July 2018 were enrolled in the group A， and 35 patients with complete remission of immune thrombocytopenia who were admitted in the hospital at the same time were set as group B. 40 healthy subjects who were admitted at the same time were set as the control group（group C）. Flow cytometry was used to detect the number of peripheral blood Bregs and interleukin-10 expression in each group， and the results were analyzed and compared. Results The number of peripheral blood Bregs in group A was（3.08±0.66）%， which was lower than（5.45±0.82）% and（7.82±1.03）% in group B and group C. There was significant difference among the three groups（P<0.05）. The proportion of interleukin-10 cells in peripheral blood Bregs of group A was（32.29±8.68）%， which was significantly lower than（51.03±10.54）% and（71.88±12.28）% of group B and group C， with statistically significant difference（P<0.05）. And the proportion of interleukin-10 cells in peripheral blood Bregs of group B was lower than that of group C， and the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The occurrence of immune thrombocytopenia is closely related to Bregs. Therefore， clinicians can use Bregs as an important therapeutic target for immune thrombocytopenia to further improve the patient's disease control.

[Key words] Interleukin-10; Number of peripheral blood Bregs; Immune thrombocytopenia; Regulatory B cells

免疫性血小板減少癥（Immune thrombocytopenia，ITP）是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，約占出血性疾病總數的1/3，成人發病率約為（5～10）/10萬，育齡期女性發病率高于男性，60歲以上老年人是該病的高發群體。臨床以皮膚黏膜出血為主，嚴重者可有內臟出血，甚至顱內出血，出血風險隨年齡而增加。部分患者僅有血小板減少，沒有出血癥狀。目前已知的該病主要發病機制有：①體液和細胞免疫介導的血小板過度破壞;②體液和細胞免疫介導的巨核細胞數量和質量異常，血小板生成不足。因此，免疫性血小板減少癥是一種血小板減少性疾病[1]，可對患者的身體健康造成比較大的影響。而已知B細胞的主要功能是介導體液免疫，因此常被認為是免疫應答的正向促進因素。直到1974年有學者發現將去除B細胞的脾細胞過繼轉移給豚鼠后，不能抑制其遲發型超敏反應，首次證明了B細胞的負向免疫調控作用，該研究表明B細胞中存在一群具有免疫調節功能的B細胞亞群，但其具體分子生物學機制并未深入闡述。直到1996年，Wolf等[2]在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的小鼠模型中發現，與有自愈傾向的野生型小鼠相比，EAE可使B細胞缺陷的C57BL/6小鼠疾病進一步進展，表明小鼠體內可能存在抑制炎癥反應的B細胞亞群。此后， 該群B細胞亞群引起研究者的廣泛關注。進一步研究表明這群B細胞通過分泌調節性細胞因子（IL-10、TGF-β）等及細胞間接觸等方式作用于其他免疫細胞，從而抑制免疫應答，這群B細胞稱為調節性B細胞（Bregs）。相關資料中曾提及[3]，調節性B細胞能夠通過對白細胞介素-10進行分泌的方式，發揮其抑制免疫應答的作用。若Bregs缺失與（或者）功能減弱，將會引發自身免疫性疾病，并能在一定程度上加重患者的病情[4]。故而，通過對免疫性血小板減少癥患者的Bregs數量和功能進行檢測，可為其病情程度的判斷提供幫助并有助于指導治療[5]。此研究中，本文將著重分析免疫性血小板減少癥患者的調節性B細胞的數量與功能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年10月～2018年7月就診于湖州市中心醫院初診為免疫性血小板減少癥的患者40例，作為A組，其中男21例，女19例;年齡25～70歲，平均（38.24±5.16）歲;血小板計數低于100×109/L。2016年10月～2018年7月期間本院接診的完全緩解免疫性血小板減少癥患者35例作為B組，其中男19例，女16例;年齡24～71歲，平均（39.02±5.84）歲;血小板計數為（100～300）×109/L。2016年10月～2018年7月期間本院接診的健康體檢者40名作為C組，其中男22例，女18例;年齡24～72歲，平均（38.97±5.46）歲。所有入選者均簽署知情同意書，有完整的臨床資料，依從性良好，獲得醫學倫理委員會批準。此研究排除依從性較差者、中途退出試驗者以及未簽署知情同意書者。各組的就診時間以及性別構成比等基線資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）所用試劑和儀器。鼠抗人CD24抗體（經PE標記）、鼠抗人CD38抗體（經APC標記）、鼠抗人CD19抗體（經FITC標記）由“美國Becton Dickinson公司”提供，鼠抗人白細胞介素-10（經PerCP-Cy5.5標記）由“美國Biolegend公司”提供，各抗體的同型對照、破膜劑和溶血素由“美國BD公司”提供，FACSCalibur型流式細胞儀由“美國BD公司”提供。

（2）采取流式細胞術對外周血Bregs數量進行檢測。取各組的外周靜脈血約10 μL，經EDTA抗凝處理后，向血液標本中分別加入20 μL的鼠抗人CD38抗體、鼠抗人CD19抗體以及鼠抗人CD24抗體，并將之置于4℃的環境中進行孵育，待15 min之后再加入溶血素（1 mL）。避光放置10 min后，進行離心處理，控制離心時間為5 min，此后，再利用磷酸鹽緩沖液進行洗滌，并按要求加入磷酸鹽緩沖液，用量為300 μL。利用流式細胞儀對3萬個細胞進行計數，同時對Bregs數量進行檢測。

（3）采取流式細胞術對外周血Bregs功能分子分泌的白細胞介素-10的數量進行檢測。取各組的外周靜脈血約200 μL，經EDTA抗凝處理后，在血液標本中分別加入20 μL的鼠抗人CD38抗體、鼠抗人CD19抗體、鼠抗人CD24抗體與同型對照。于4℃的環境下進行避光孵育，待15 min之后再加入1 mL的溶血素，于避光放置10 min后進行離心處理，控制離心時間為5 min。此后，再加入600 μL的破膜劑，于室溫且避光的環境中進行保存，10 min后，利用磷酸鹽緩沖液（1 mL）進行洗滌，然后再分別加入5 μL的鼠抗人白細胞介素-10抗體與同型對照。于4℃、避光的環境下進行孵育，15 min后，經磷酸鹽緩沖液進行洗滌后，加入磷酸鹽緩沖液300 μL。利用流式細胞儀對5萬個細胞進行計數，同時對Bregs細胞中的白細胞介素-10的表達水平進行檢測。

1.3 治療方法和療效判斷標準

針對此研究中所納入的免疫性血小板減少癥患者，均予以糖皮質激素治療，潑尼松的每日用藥量為1 mg/kg，并根據患者的病情狀況，對部分患者輔以重組人血小板生成素與丙種球蛋白治療，其中，重組人血小板生成素的每日用藥量為300 IU/kg，連續治療14 d，丙種球蛋白的每日用藥量為400 mg/kg，連續治療5 d。而免疫性血小板減少癥的診斷和治療效果判斷均參考《血液病診斷及療效標準》[6]中的相關內容。

1.4 評價指標

對A、B、C三組的檢測結果進行分析和比較，包括外周血Bregs數量和功能以及外周血Bregs中白細胞介素-10的細胞比例。

1.5 統計學處理

本研究所有數據均采取SPSS20.0統計學軟件進行數據處理，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗;計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bregs數量分析

A組的Bregs數量比B、C兩組低，組間差異顯著，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 外周血Bregs中白細胞介素-10細胞比例分析

A組Bregs水平、外周血Bregs中白細胞介素-10細胞比例均低于B組與C組，差異有統計學意義（P<0.05），同時B組Bregs水平、外周血Bregs中白細胞介素-10細胞比例低于C組健康體檢者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

迄今為止，臨床上還尚未能研究出免疫性血小板減少癥的確切病因[7]，但有報道稱，異常B淋巴細胞形成抗體乃免疫性血小板減少癥的一個重要致病環節[8]。而Bregs則是機體免疫系統中比較重要的一個組成部分，其能夠分泌白細胞介素-10，并由此起到對免疫系統進行負向免疫調節的作用，而Bregs數量的減少和功能的失調則極有可能會引發自身免疫性疾病，亦或者是加重患者的病情[9-11]。白細胞介素-10能夠對從Th0細胞分化成為Th2細胞的過程進行誘導，可抑制CD4+T細胞向Th1、Th17細胞分化，同時可抑制Th1、Th17細胞的活化和分化，使得Th1/Th2失去平衡，促使CD4+T細胞向Treg細胞和Tr1細胞轉化，并能夠對樹突狀細胞對白細胞介素-6以及白細胞介素-12的分泌過程進行有效的抑制[12-15]。相關資料中提及[16]，對于免疫性血小板減少癥患者來說，其Th17細胞數量明顯增加，Th1/Th2出現極化異常的情況，且調節性T細胞水平明顯降低。雖然IL-10是Bregs參與抑制免疫應答的主要細胞因子，但仍有一些其他因子，如TGF-β、IL-35、CD1d、CD80、CD86、PD-L1、CTLA-4、IDO、IgG4等參與輔助Bregs與其他免疫細胞相互作用，進而使Bregs發揮抑制免疫應答的功能[17]。

本研究中，A組的Bregs數量比B、C兩組低，差異有統計學意義（P<0.05）;A組外周血Bregs中白細胞介素-10的細胞比例比B、C兩組低，組間差異顯著，差異有統計學意義（P<0.05）;B組外周血Bregs中白細胞介素-10的細胞比例比C組低，差異有統計學意義（P<0.05）。由此說明，免疫性血小板減少癥的發生、發展過程當中，Bregs起著至關重要的作用，在臨床治療中，通過提高患者的Bregs水平及相關功能，有助于更好地緩解患者的病情，改善預后效果。

mDC能夠對Th1免疫應答進行誘導，可加快細胞免疫發生的速度[18]。pDC和mDC能夠通過分泌出的細胞因子進行相互抑制，對于免疫性血小板減少癥患者來說，其機體中的pDC水平明顯增加，從而對mDC進行有效的抑制，使得mDC水平明顯降低[19]，表明mDC在免疫性血小板減少癥的發生過程中可能起到了一定的推動作用[20]。相關資料中提及，對于免疫性血小板減少癥患者來說，其Bregs和mDC為正相關的關系，表明Bregs和mDC有可能均參與免疫性血小板減少癥的免疫病理過程;Bregs和外周血血小板計數表現出正相關的關系，表明Bregs水平和免疫性血小板減少癥的發生與進展有著較為密切的關系。

Bregs的發現為研究免疫性血小板減少癥開辟了一個新的領域。本研究發現，免疫性血小板減少癥患者的Bregs數量和功能較完全緩解患者和健康人群均有明顯降低，且同疾病的嚴重程度有著較為密切的關系。在免疫性血小板減少癥的發生機制中，Bregs有著比較顯著的推動作用，通過對Bregs數量和功能進行檢測，能夠為臨床醫師評估免疫性血小板減少癥患者的病情及預后提供新的評判指標，且該研究結果有助于在臨床工作中通過檢測免疫性血小板減少癥患者的Bregs數量及功能變化，更全面地評估患者療效，同時為臨床未來靶向治療該疾病提供新的方向。

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（收稿日期：2018-09-25）