ALK4對心肌梗死后心肌纖維化的影響和作用機制

陳一和 林慧 逯朝陽 相銀 劉俊

[摘要] 目的 研究ALK4在心梗后心肌纖維化中的作用及分子機制。 方法 利用ALK4+/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠構(gòu)建心梗模型，通過天狼星紅染色檢測纖維化，用WB、Real-time PCR、免疫組化技術(shù)檢測梗死邊緣區(qū)α-SMA、collagen1a-1、CTGF的表達，探討ALK4在心梗后心肌纖維化中的作用。分離及培養(yǎng)原代ALK4+/-小鼠心臟成纖維細胞，在低氧刺激下（1% O2）研究ALK4對心臟成纖維細胞增殖、分化和分泌合成功能的影響。 結(jié)果 心梗后第28天，梗死邊緣區(qū)ALK4蛋白表達水平升高，ALK4敲除后則顯著少其表達。與野生型同窩對照小鼠（WT）相比，ALK4+/-小鼠梗死后生存率提高[ALK+/-（77.1）% vs WT（54.3）%，P<0.05]，心臟功能改善[LVEF：ALK+/-（48.5±3.5）% vs WT（29.3±3.8）%，P<0.05;FS：ALK+/-（24.5±2.2）% vs WT（13.9±1.9）%，P<0.05]，梗死邊緣區(qū)心肌纖維化減少[ALK+/-（32.1±2.0）% vs WT（22.5±2.2）%，P<0.05]。細胞實驗中，ALK4敲除則顯著抑制低氧刺激下心臟成纖維細胞增殖[ALK4+/-（2.68±0.23） vs W（1.86±0.42），P<0.05]、分化[ALK4+/-（2.72±0.21） vs WT（1.43±0.31），P<0.05]和分泌合成[ALK4+/-（9.87±0.74） vs WT（4.13±1.31），P<0.05]。ALK4+/-敲除抑制低氧下Smad3的磷酸化水平[ALK4+/-（1.64±0.17） vs WT（2.79±0.32），P<0.05]而不影響Smad4表達量。 結(jié)論 ALK4表達抑制可顯著抑制心梗后心肌纖維化，改善心室功能和生存率以及鈍化心臟成纖維細胞對低氧刺激的反應(yīng)，其作用主要通過抑制Smad3/4信號通路。

[關(guān)鍵詞] ALK4;心肌梗死;心肌纖維化;心臟成纖維細胞

[中圖分類號] R285? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）36-0029-05

[Abstract] Objective To study the role and molecular mechanism of ALK4 in myocardial fibrosis after myocardial infarction. Methods The MIK4+/- mice and wild-type C57BL/6 mice were used to construct the myocardial infarction model. Fibrosis was detected by Sirius red staining. WB， Real-time PCR and immunohistochemical techniques were used to detect the expression of α-SMA， collagen1a-1 and CTGF in the infarct edge zone. The role of ALK4 in myocardial fibrosis after myocardial infarction was explored. Primary ALK4+/- mouse cardiac fibroblasts were isolated and cultured， and the effects of ALK4 on proliferation， differentiation and secretion of cardiac fibroblasts were studied under hypoxia（1% O2）. Results On the 28th day after myocardial infarction， the expression level of ALK4 protein in the infarct border area was increased， and the expression was significantly less after ALK4 knockout. Compared with that of the wild-type littermate control mice （WT）， the post-infarction survival rate （ALK+/- （77.1）% vs. WT （54.3）%， P<0.05） and cardiac function （LVEF：ALK+/-（48.5±3.5）% vs WT （29.3±3.8）%， P<0.05; FS： ALK+/- （24.5±2.2）% vs WT （13.9±1.9）%， P<0.05） was improved， and myocardial fibrosis was reduced in the infarct border zone （ALK+/- （32.1±2.0）% vs WT （22.5±2.2）%， P<0.05） in ALK4+/- mice. In cell experiments， ALK4 knockout significantly inhibited cardiac fibroblast proliferation under hypoxic stimulation （ALK4+/- （2.68±0.23） vs WT （1.86±0.42）， P<0.05）， differentiation（ALK4+/- （2.72± 0.21） vs WT （1.43±0.31）， P<0.05） and secretory synthesis （ALK4+/- （9.87±0.74） vs WT （4.13±1.31）， P<0.05）. ALK4+/- knockdown inhibited the phosphorylation of Smad3 under hypoxia（ALK4+/- （1.64±0.17） vs WT （2.79±0.32）， P<0.05） without affecting the amount of Smad4 expression. Conclusion The inhibition of ALK4 expression can significantly inhibit myocardial fibrosis after myocardial infarction， improve ventricular function and survival rate， and inactivate the response of cardiac fibroblasts to hypoxia stimulation， mainly through inhibition of Smad3/4 signaling pathway.

[Key words] ALK4; Myocardial infarction; Myocardial fibrosis; Cardiac fibroblast

心肌纖維化是心梗后心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程中至關(guān)重要的病理性改變，盡管在梗死早期可有效防止心臟破裂，但是過度纖維化降低心臟順應(yīng)性，損害收縮舒張功能，影響血流動力學，導致心力衰竭、惡性室性心律失常的發(fā)生[1-3]。因此，針對心梗后心臟纖維性重構(gòu)進行有效的干預是臨床研究和治療的關(guān)鍵。

活化素受體樣激酶4（activin receptor-like kinase 4，ALK4）是位于細胞膜上的一類Ⅰ型活化素受體，隸屬TGF-β受體超家族，在組織中廣泛表達，是參與調(diào)控機體生理及病理過程的關(guān)鍵因子。ALK4的功能涉及胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)分化、生殖細胞發(fā)育、腫瘤形成及免疫抑制等[4-6]。其作用主要通過磷酸化Smad2/3信號通路分子C端的絲氨酸殘基，除外Smad2/3信號通路還可通過MAPKs、Akt/PI3K、Wnt/β-catenin等，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達[4]。Takagi等[7]發(fā)現(xiàn)ALK4在系統(tǒng)性硬化病患者的皮膚組織中表達升高，與皮膚纖維化密切相關(guān)。但ALK4在心梗后心臟重構(gòu)，尤其是心肌纖維化中的作用尚不明確。因此我們將從組織水平和細胞水平兩個層面對ALK4在心梗后心肌纖維化中的分子細胞機制進行詳盡的研究，為臨床治療提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

ALK4+/-小鼠，小動物氣體麻醉機，小動物呼吸機，天狼星紅染液，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，CCK-8試劑盒，ALK4抗體（abcam公司），p-Smad3抗體（abcam公司），Smad4抗體（abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗時間? 選擇2017年1月～2018年6月，在體動物實驗時間均為心梗模型構(gòu)建后第28天進行心超檢測，心臟取材、后續(xù)分子生物學檢測。離體細胞實驗均采用低氧1%連續(xù)刺激24 h候后進行劃痕試驗、CCK-8及分子生物學檢測。

1.2.2 心梗模型構(gòu)建? 選取10～12周齡，體重在22～25 g之間的ALK4+/-小鼠和野生型同窩對照小鼠構(gòu)建心梗模型。用2%異氟烷將小鼠麻醉，固定于鼠板，行氣管插管并連接氣體麻醉機和小動物呼吸機。對左側(cè)胸前區(qū)進行備皮，鈍性分離、暴露第四肋間隙并開胸，用6-0的帶線縫合針在左心耳下方2 mm處結(jié)扎前降支，至心肌組織明顯發(fā)白以確保心梗。術(shù)畢逐層關(guān)閉胸腔，縫合皮膚。術(shù)后皮下注射青霉素80萬U預防感染，每日觀察小鼠的生存狀況，心梗后28 d對心功能、病理組織學及分子生物機制進行檢測。

1.2.3 心功能檢測? 心梗后第28天對各組小鼠進行心臟B超檢測，用2%異氟烷麻醉小鼠，備皮后仰臥于超聲工作臺并固定，采用小動物超聲診斷儀，頻率為15 MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，分別測量左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）、左室縮短分數(shù)（FS）和左室射血分數(shù)（EF）。

1.2.4 心臟組織病理學檢測? 心梗后28 d，將心臟取出，4%多聚甲醛固定48 h，修剪包埋。將心臟組織浸于梯度酒精脫水后在二甲苯中進行透明。隨后進行透蠟，包埋，切片（厚度約為5 μm）。脫蠟水化后進行天狼星紅，流水沖洗后，中性樹脂封片。心臟組織切片進行collagen Ia1的免疫組化時，除上述步驟外，還需高溫抗原修復，collagen Ia1一抗孵育過夜。翌日，洗片后二抗孵育，DAB顯色并在顯微鏡下觀察，并計算梗死邊緣區(qū)collagen Ia1陽性染色的面積。

1.2.5 Real-time PCR檢測? 取心肌組織，加入Trizol試劑進行充分研磨、勻漿。加酚、氯仿提取上清液并用異丙醇沉淀RNA，酒精洗滌、晾干后溶解于DEPC水，測RNA濃度。使用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，加入CTGF的引物和SYBR熒光染料，以GAPDH為內(nèi)參，采用ABI 7500 Fast（Applied Biosystems）檢測其CT值并計算該目的基因的相對表達量（2-ΔΔCT）。

1.2.6 Western blot檢測? 取心肌組織，加入蛋白裂解液（RIPA+PMSF），充分研磨、勻漿。將組織液置于冰上靜置30 min后，離心取上清液。采用BCA法測定樣品的蛋白濃度，加熱使蛋白變性。隨后分別配置分離膠和濃縮膠，在樣孔內(nèi)加入蛋白樣品進行電泳。之后將蛋白從膠中轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜。翌日，洗膜，室溫下二抗孵育1 h。打開顯影儀和軟件，待機器預冷。配置ECL發(fā)光液（A液和B液比例為1∶1），加至PVDF膜上后進行顯影。采集的圖像使用IPP軟件分析。

1.2.7 心臟成纖維細胞分離? 取1～2 d 的ALK4+/-和野生型C57BL-6乳小鼠，置于75%乙醇消毒并處死。用眼科剪剪取心臟，去除結(jié)締組織、心房、肺等組織，將心肌組織剪碎至1 mm3大小，加入0.25%胰酶，37%磁轉(zhuǎn)消化，分離細胞。離心后將沉淀的細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打均勻，種于6 cm細胞培養(yǎng)皿中，差速貼壁1 h，得到心肌成纖維細胞。原代心臟成纖維細胞傳至2～4代時用于后續(xù)實驗。

1.2.8 CCK8檢測? 將分離、培養(yǎng)至第2～4代的心臟成纖維細胞用0.5%胰酶消化1～2 min后，用含10%FBS培養(yǎng)基中和，離心后棄去上清，培養(yǎng)基重懸。計數(shù)2 000個細胞種于96孔板中過夜。翌日，用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h，更換含10% FBS培養(yǎng)基并置于1%的低氧培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，配制含CCK-8的培養(yǎng)基（比例為1∶10），96孔板中各孔加入100 μL。37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。在酶標儀上設(shè)置檢測波長為450 nm，測定吸光度。

1.2.9 劃痕試驗? 將分離、培養(yǎng)至第2～4代的心臟成纖維細胞種于6孔板中，每孔約5×105細胞量直至70%～80%的密度。用無菌的200 μL槍頭在各孔中劃一筆直的劃痕。PBS洗滌3次，每次3 min。洗去因劃痕而死亡脫落的細胞。顯微鏡下拍照，以顯示最初始的兩側(cè)心臟成纖維細胞間的距離。隨后加入不含血清的培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拍攝各組細胞之間的遷移情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。生存率的比較采用Log-rank （Mantel-Cox）檢驗方法。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ALK4敲除改善心梗后死亡率和心功能

心梗后梗死邊緣區(qū)ALK4表達增加，ALK4敲除顯著抑制心梗后ALK4蛋白表達（P<0.05）。心梗后28 d，與野生型同窩對照小鼠相比，ALK4+/-小鼠生存率升高[ALK+/-（77.1）% vs WT（54.3）%，P<0.05]。心臟超聲結(jié)果顯示ALK4+/-小鼠的LVEF和FS較野生型小鼠均明顯改善[LVEF：ALK+/-（48.5±3.5）% vs WT（29.3±3.8）%，P<0.05;FS：ALK+/-（24.5±2.2）% vs WT（13.9±1.9）%，P<0.05]。

2.2 ALK4敲除減少心肌纖維化和心肌組織間細胞外基質(zhì)沉積

心梗后28 d，ALK4敲除后梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)纖維化改善[ALK+/-（32.1±2.0）% vs WT（22.5±2.2）%， P<0.05]。Real-time PCR結(jié)果顯示ALK4敲除顯著減少梗死邊緣區(qū)collagen Ia1的表達[ALK+/-（4.28±0.65） vs WT（1.33±0.21），P<0.05]。

2.3 ALK4敲除抑制低氧刺激下成纖維細胞增殖、分化和分泌功能

與野生型心臟成纖維細胞相比，低氧刺激24 h ALK4+/-心臟成纖維細胞PCNA表達減弱，提示增殖能力下降[ALK4+/-（2.68±0.23） vs WT（1.86±0.42），P<0.05]。ALK4敲除抑制低氧誘導的α-SMA表達[ALK4+/-（2.72±0.21） vs WT（1.43±0.31），P<0.05]。同時，ALK4敲除還抑制低氧刺激下心臟成纖維細胞collagen Ia1表達合成[ALK4+/-（9.87±0.74） vs WT（4.13±1.31），P<0.05]。

2.4 ALK4通過Smad3/4信號通路調(diào)控心臟成纖維細胞功能

低氧刺激促進心臟成纖維細胞Smad3的磷酸化，而不影響Smad4蛋白表達，與野生型心臟成纖維細胞相比，ALK4+/-心臟成纖維細胞磷酸化Smad3表達量下降[ALK4+/-（1.64±0.17） vs WT（2.79±0.32），P<0.05]而Smad4蛋白表達量無變化。

3 討論

心肌纖維化是心血管各類病因（高血壓、高血糖、高血脂、柯薩奇病毒及抗腫瘤藥物等）導致心臟損傷后病理表現(xiàn)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[1，2]。心梗后心肌細胞壞死凋亡，心臟成纖維細胞替代、修復以維持心臟完整的結(jié)構(gòu)，防止心臟破裂[8]。然而病理刺激過度的纖維化則影響心臟收縮舒張功能。心肌纖維化的分子機制十分復雜，已知炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)功能亢進、RAAS系統(tǒng)激活以及細胞因子均參與調(diào)控這一過程[9]。

TGF-β信號通路是介導心臟重構(gòu)的重要信號通路，抑制TGF-β/ALK5通路活性可以顯著改善大鼠心梗后收縮功能失代償和左心室重構(gòu)[10，11]。同時，研究證實除TGF-β之外的其他TGF-β超家族成員如Activin A、GDF-15、ALK2和ALK7亦參與這一結(jié)構(gòu)重構(gòu)的過程[12]。Activin A刺激促進乳鼠心肌細胞大量表達MMP-9、TIMP-1和TGF-β1，與心肌組織纖維化密切相關(guān)[12]。Kempf等發(fā)現(xiàn)急性心?；颊呷毖獏^(qū)心肌細胞GDF-15前肽的表達升高，通過對小鼠GDF-15基因敲減后發(fā)現(xiàn)梗死范圍增大，心肌細胞凋亡增加，從而確證GDF-15在缺血再灌注損傷中對心臟的保護作用[13]。Shahid等[14]發(fā)現(xiàn)心臟條件性敲除ALK2可以逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ刺激下的心臟不良重構(gòu)，恢復心臟功能。Huang等[15]證實ALK7表達的抑制加重了心肌肥厚，心肌間質(zhì)和血管周圍纖維化，惡化心臟功能，而過表達ALK7則發(fā)揮相反的作用。上述研究結(jié)果表明除廣泛研究的TGF-β/ALK5信號通路，其他TGF-β超家族的配體和（或）受體同樣涉及心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)的過程。

ALK4是位于細胞膜上的一類Ⅰ型TGF-β受體，既往研究發(fā)現(xiàn)其主要參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展，毛發(fā)生發(fā)及免疫過程[4，5，16，19，20]。在心臟組織發(fā)育形成中，ALK4是促進胚胎細胞向心肌細胞分化的關(guān)鍵因子，揭示其在心血管領(lǐng)域的重要性[6]。近年來對ALK4研究的深入發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化患者的皮膚組織中ALK4表達升高，同時下游的Smad2/3信號通路激活[7]。系統(tǒng)性硬化病又稱為硬皮病，是一種以局限性或彌漫性皮膚纖維化為特征的全身性自身免疫病。病變特點主要為皮膚纖維增生，最終導致皮膚硬化、血管缺血。但是到目前為止，ALK4在心梗后心肌纖維化中的作用和機制尚未闡明。課題組通過比較ALK4小鼠和野生型小鼠心梗后心功能、心肌纖維化程度的差異以明確ALK4在心梗后心肌纖維性重構(gòu)中的作用。我們首次發(fā)現(xiàn)心梗后第28天，ALK4敲除小鼠心肌纖維化程度減弱，心肌組織中細胞外基質(zhì)沉積減少，心功能明顯改善。由此我們推斷ALK4參與小鼠心梗模型下心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)，并與心梗后心肌纖維化密切相關(guān)。而細胞實驗的結(jié)果證實ALK4敲除后的心臟保護作用主要依賴于抑制心臟成纖維細胞的激活（增殖、分化、遷移和分泌合成功能下降）。在分子機制上，ALK4在心肌纖維化中的一系列作用主要是通過激活經(jīng)典的Smad3/4信號通路。Smads信號分子是參與纖維性疾病重要的通路，而Smad2/3/4是目前已知的介導ALK4作用的主要信號通路[17]。既往研究證實Smad3敲除小鼠對心梗后局部的炎癥反應(yīng)無明顯影響，主要是減少梗死邊緣區(qū)的心肌纖維化同時抑制遠隔區(qū)域的反應(yīng)性的纖維化從而改善心臟功能。體外實驗同樣顯示Smad3磷酸化與心臟成纖維細胞分化、增殖密不可分，此外Smad3還可介導TGF-β對成纖維細胞的激活，促使成纖維細胞功能增強[18]。因此揭示了ALK4-Smad3/4信號通路對心梗后心肌纖維化的影響。

此外，本研究結(jié)果仍需要進一步使用對ALK4具有高度選擇性的抑制劑，從外源性抑制其表達和（或）功能來驗證，同時也可為臨床藥物應(yīng)用提供新的選擇。既往報道和我們的繁殖記錄均顯示ALK4小鼠純合致死，所以研究均使用ALK4+/-小鼠完成，對ALK4表達抑制的程度并不徹底。同時根據(jù)研究結(jié)果顯示ALK4表達升高主要在于心臟成纖維細胞，提示我們想要更深入闡明ALK4在心梗后心肌纖維化中的作用，進一步驗證我們現(xiàn)有的結(jié)果和完善證據(jù)，需要構(gòu)建成纖維細胞特異性的ALK4敲除小鼠。

因此本實驗研究證實 ALK4通過調(diào)控心臟成纖維細胞增殖、分化、遷移以及分泌合成的功能介導心梗后心肌纖維化的過程，其作用機制主要通過Smad3/4信號通路介導，其功能的明確將為臨床治療提供新的可靠的干預靶點。

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（收稿日期：2018-06-14）