姜黃素拮抗LPS活化巨噬細胞對胰島β細胞的損傷

史立言，劉 巖，陳 為，孟繁平，李 妍*

(1.吉林醫藥學院檢驗學院,吉林 吉林132013;2.延邊大學醫學院,吉林 延吉133002)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，雖然糖尿病的病因和發病機制尚未完全闡明，但越來越多的證據表明，免疫損傷因素參與胰腺的損傷[1]。胰島主要是由4類內分泌細胞組成，分泌胰島素的 β細胞組成胰島核心,而α、δ及 PP細胞組成胰島外殼。胰腺是血管密集、血供豐富的器官，當巨噬細胞(macrophage,Mφ)被趨化而浸潤入胰島微環境，可分泌細胞因子及釋放NO等，參與β細胞損傷。感染、代謝和損傷因素刺激下，Mφ的極化將導致其分泌細胞因子和功能的改變[2]。細菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)結合Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR-4)而活化Mφ，姜黃素(curcumin)具有抗炎效應[3]。本研究將探討其是否可通過調節Mφ極化而減輕活化巨噬細胞對胰島β細胞的損傷。

1 材料與方法

1.1材料小鼠細胞巨噬細胞RAW264.7和小鼠胰島β細胞Min-6保存于液氮中。1640培養液、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)購自Gibco公司。PE熒光素標記抗小鼠CD40、CD86和CD206的抗體購自天津三箭生物技術有限公司；LPS和活性氧(ROS)熒光探針雙氯熒光黃乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)溶液購自上海碧云天生物科技有限公司；雙染凋亡檢測試劑盒和酶聯免疫吸附技術(ELISA)檢測小鼠TNF-α試劑盒購eBioscience公司。姜黃素購自Sigma Aldrich公司。

1.2細胞培養和處理復蘇液氮凍存RAW 264.7細胞，在含10% 小牛血清1640培養液、5% CO2、飽和濕度37 ℃培養；用含0.25% 胰蛋白酶和0.2% 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA) 的消化液消化細胞，每周傳代2-3 次，取對數生長期細胞用于實驗。按1×106/孔接種細胞于6孔培養板，按如下分組加入LPS和姜黃素:對照組(control)，脂多糖(LPS)組(2 μg /mL)，姜黃素(curcumin)組(7.5 μmol/L ) 和聯合處理組(2 μg /mL LPS+ 7.5 μmol/L curcumin) 。繼續培養細胞24 h，收集培養物上清液于-20℃凍存，消化并收集細胞，完成后續實驗。復蘇并培養Min-6細胞，按1×106/孔接種于6孔培養板，細胞恢復貼壁生長后，按25%比例加入不同實驗分組處理后的RAW 264.7細胞上清液，不添加RAW 264.7細胞上清液組為對照組；繼續培養24 h后，消化收集Min-6細胞，完成后續實驗。

1.3免疫熒光染色和流式細胞術取不同處理因素作用后的RAW264.7細胞，每組 5×105個細胞，懸于100 μl PBS，加入1 μg FITC 標記抗CD 40抗體或陰性對照抗體，4 ℃下避光反應30 min。PBS洗2次后用400 μl的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測陽性表達細胞百分率。相同的方法檢測CD86和CD206表達。

1.4ROS檢測取不同處理因素作用后的RAW264.7細胞，每組 5×105個細胞，懸100 μl PBS ，加入DCFH-DA 儲存液，至其終濃度為 5 μmol/L，混勻后在 37 ℃避光反應 30 min，PBS洗2次，400 μl PBS 重懸細胞，流式細胞儀分析細胞內熒光，以熒光強度均值代表細胞內ROS含量。

1.5ELISA取不同處理因素作用的RAW 264.7 細胞上清液，按照 ELISA 試劑盒操作說明測定 檢測TNF-α含量，每個處理因素設3個復孔。

1.6細胞凋亡檢測取不同處理因素作用后Min-6細胞，每組 5×105個細胞，用195 μl結合緩沖液重懸細胞，加入 5 μl Annexin-V-FITC 工作液，室溫下避光反應 30 min；結合緩沖液洗滌細胞2次，400 μl結合緩沖液重懸細胞，加入PI 溶液5μl,立即上機用流式細胞儀分析。

2 結果

2.1LPS和姜黃素對RAW264.7細胞膜分子表達的影響

實驗結果表明，LPS和姜黃素對RAW264.7細胞膜分子CD40、CD86和CD206的表達均有影響(表1)。與對照組比較，脂多糖組CD40和CD86表達增加，而CD206表達減少；姜黃素組CD206表達明顯增加，CD40和CD86略下降。與脂多糖組比較，聯合處理組CD206表達略增加，CD40和CD86下降。

表1 LPS和姜黃素對RAW264.7細胞膜分子表達的影響

*與對照組(control)比較，P<0.05**與脂多糖組(LPS)比較，P<0.05

2.2LPS和姜黃素對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響

通過檢測發現，LPS可促進RAW264.7釋放TNF-α入細胞培養上清液，而姜黃素處理后，細胞分泌TNF-α較脂多糖組明顯減少(表2)。

表2 LPS和姜黃素對RAW264.7分泌TNF-α的影響

*與對照組(control)比較，P<0.05**與脂多糖組(LPS)比較，P<0.05

2.3LPS和姜黃素對RAW264.7細胞活性氧的影響

ROS主要由細胞內線粒體產生，巨噬細胞在活化、吞噬和殺傷病原體的過程中伴隨ROS增加[4]。通過熒光探針法檢測細胞活性氧，對照組(control)，脂多糖(LPS)組(2 μg /mL)，姜黃素(curcumin)組(7.5 μmol/L ) 和聯合處理組代表ROS含量的熒光強度值分別為12.4±1.3，25.7±2.8，9.7±0.9和11.6±1.0(圖1)。分析表明，LPS導致細胞內ROS顯著增加，而低濃度的姜黃素對細胞內ROS僅有弱的減少效應(與對照組比較P<0.05)；但姜黃素能能顯著減少LPS激發的活性氧(與脂多糖組比較P<0.05)。

圖1 LPS和姜黃素對RAW264.7細胞活性氧的影響

2.4姜黃素拮抗LPS活化巨噬細胞對Min-6細胞的損傷

采用雙染法檢測Min-6細胞凋亡情況，用新鮮培養液培養組作為空白組(blank),而添加不同條件培養液組對應命名，即對照組(control)，脂多糖(LPS)組(2 μg/mL)，姜黃素(curcumin)組(7.5 μmol/L ) 和聯合處理組(LPS +curcumin)。

3 討論

糖尿病發生發展的核心是胰島β細胞的功能障礙[5]。多項研究顯示，多種炎癥因子可對胰島β細胞造成損傷，包括TNF-α、IFN-γ和IL-1β等[6]，損傷的胰島β細胞刺激巨噬細胞活化，致使其分泌更多的炎性因子，進一步加重胰島細胞的損傷[7]。因此，抑制巨噬細胞活化，使其向調節性分化，可能成為糖尿病的治療手段之一。姜黃素是一種從姜科、天南星科植物的根莖中提取出的一種成分，是傳統中藥姜黃的主要成分，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及降血脂等作用[8]。研究表明，它不僅能夠抑制巨噬細胞活化，而且具有使已活化的巨噬細胞向調節型轉變的功能[9]。LPS是細菌細胞壁的主要成分，可刺激巨噬細胞活化，產生炎癥[10]。本研究中，利用LPS誘導小鼠巨噬細胞Raw264.7，使其發生M1型極化，并以其產生的含有炎癥因子的培養液上清作用于小鼠胰島Min-6細胞，模擬體外炎癥損傷模型。結果顯示，LPS使Raw264.7細胞膜分子CD40和CD86表達均有增加，而CD206表達減少，且TNF-α分泌增加，細胞內ROS增加，表明成功建立炎癥模型；而加入姜黃素后，以上指標的變化明顯減弱甚至被逆轉。將M1極化后的Raw264.7培養上清加入Min-6細胞后，以姜黃素干預后的炎癥模型與之對比，雙染凋亡結果顯示，Min-6細胞受到M1極化的巨噬細胞炎癥因子刺激，凋亡比例明顯增加，而姜黃素可顯著抑制其損傷作用，提示姜黃素可能拮抗巨噬細胞的活化，保護炎性因子對胰島細胞的損傷。

圖2 姜黃素拮抗LPS活化巨噬細胞對Min-6細胞的損傷

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