大口黑鱸EST-SNP標記開發及其與生長性狀的相關性分析

李勝杰，白俊杰，趙 犖，朱 冰，朱新平

（1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）俗名加州鱸，原產于北美洲，屬廣溫性魚種，在分類學上隸屬鱸形目太陽魚科。大口黑鱸具有肉質鮮美、無肌間剌、適合高密度養殖和長途運輸等特點，自上世紀70年代被引入我國大陸后進行廣泛養殖，現已成為我國重要的淡水養殖品種之一，年產量超35萬噸［1］。隨著養殖規模不斷擴大，集約化程度不斷提高，大口黑鱸疾病頻發、生長不理想和養殖成本上升等制約了我國大口黑鱸養殖業的可持續健康發展。因此，有必要通過人工選育提高養殖品種的生長性能，為大口黑鱸養殖產業發展提供良種支撐。

分子標記輔助育種技術是通過與目標性狀緊密連鎖的分子標記對目標性狀進行間接選擇的現代育種技術，具有選擇強度大、不受環境影響和結果可靠等特點［2］。關聯分析是用分子標記或者候選基因的遺傳變異與經濟性狀表型聯系起來的實現分子標記輔助育種的一種有效方法［3］。單核苷酸多態性（SNP）是最常用的分子標記，由于其全基因組覆蓋率和基因分型效率高等優點，被廣泛應用于關聯分析和分子輔助育種［4-5］。目前大規模SNP標記信息的獲得主要是通過基因組測序，但這種方法成本高，對于沒有基因組信息的非模式生物，可用轉錄組測序來開發大量 SNP標記［6］。SALEM等［7］應用 RNASeq技術對虹鱒（Oncorhynchusmykiss）生長快和生長慢群體轉錄組進行分析，將測序數據與轉錄組參考序列比對后篩選出兩個群體的差異SNP，并與群體生長性狀進行關聯分析，共鑒定出22個與生長性狀相關的 SNP。ULLOA等［8］采用RNA-seq技術分析了斑馬魚（Barchydanio rerio）生長快和生長慢群體的轉錄組，對獲得的164個候選SNP標記與生長性狀進行關聯分析，篩選出5個生長相關標記。本研究采用RNA-seq技術分析大口黑鱸生長快和生長慢個體肌肉組織轉錄組，通過SnaPshot分型技術驗證候選SNP標記，并進一步分析標記與生長性狀相關性，以期為大口黑鱸生長相關分子標記開發和分子標記輔助育種研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大口黑鱸“優鱸1號”是經連續多代選育而獲得的生長性能優良的養殖新品種［9］。為測試其生長性能，對同為2月齡的大口黑鱸“優鱸1號”和非選育大口黑鱸注射CWT標記后在佛山市南海區九江鎮新旭養殖場的同一口池塘中進行養殖，每天用冰鮮魚投喂，一天喂養兩次（8∶30和16∶30）。11月齡時，在大口黑鱸“優鱸1號”群體中采集10 ind最大個體（快長組，平均體質量為782.5±14.1g），在非選育大口黑鱸中采集10 ind最小個體（慢長組，平均體質量為249.0±8.2 g），剪取每尾魚肌肉組織凍存于液氮中，用于總RNA提取。

用于關聯分析的大口黑鱸養殖群體來自新旭養殖場，該養殖群體是9 500 ind大口黑鱸“優鱸1號”親本于2015年3月1日繁殖的后代。供試魚在相同條件下培育成魚種，然后在同一個池塘中進行養殖，全程投喂冰凍野雜魚，11月齡時從群體中隨機取430 ind測量體質量、全長、體高、頭長和尾柄長等性狀值，同時以抗凝劑（ACD）與血液體積比為6∶1的比例進行尾靜脈活體取血，按天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA試劑盒中操作說明提取DNA，用瓊脂糖（Sigma公司，美國）凝膠電泳和紫外分光光度計（Eppendorf公司，美國）測定DNA質量和濃度，于-20℃保存。DNA分子量標準購自廣州艾基生物科技有限公司。

1.2 RNA提取、文庫構建與測序

按照TaKaRa公司（大連）Trizol試劑盒說明書提取肌肉組織總RNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（Bio-Rad公司，美國）和分光光度計檢測其質量和濃度。構建RNA文庫之前，每一個RNA樣品經DNase I消化之后去除基因組DNA污染。每組中各個體的等量RNA混合一起組成測序樣品。采用OligotexmRNA Midi Kit試劑盒（Qiagen公司，美國）純化富集 Poly（A）mRNA，加入fragmentation緩沖液將mRNA打斷成200nt左右的短片段。以片段后的mRNA為模板，使用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，然后加入緩沖液、dNTP、RNase和DNA聚合酶合成 cDNA第二條鏈。通過Qiaquick PCR提取試劑盒（Qiagen公司，美國）和EB緩沖液洗脫經末端修復，對cDNA片段進行純化。對純化后cDNA片段進行加poly（A）尾及連接測序接頭，再經過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，200 bp+25 bp的cDNA片段被純化并通過PCR擴增目的片段，作為cDNA測序文庫。文庫構建和測序均委托北京基因組中心完成，采用 Illumina HiSeqTM2000平臺（Illumina公司，美國）及single-end和paired-end技術獲得原始測序數據。

1.3 轉錄組數據庫中EST-SNP標記的篩選與驗證

為篩選SNP標記，以2個轉錄組文庫產生的序列組裝而成的 unigene作為參考序列，用SOAPsnp軟件［10］比對單個 read。SNP查找限于至少被5個clean reads覆蓋的unigene，最小等位基因質量（每等位基因累計序列的質量）不低于20。從關聯分析群體中選取30 ind極大和30 ind極小個體作為SNP標記驗證群體，選擇在大口黑鱸快長組和慢長組中均存在的75個SNP標記進行驗證。對于分型成功且可能與生長性狀關聯的SNP標記進一步在其余個體中進行基因型分型，最后在大群體中做SNP標記與生長性狀的關聯分析。

委托上海捷瑞生物工程有限公司用SnaPshot方法［11］分型，具體方法如下：根據目標 SNPs側翼序列設計擴增引物，然后對每個樣品的DNA進行多重PCR擴增。PCR擴增后取3μL PCR產物用Exo I和FastAP純化，主要是用Exo I去除反應產物中的剩余引物，用FastAP去除反應中剩余的DNTP，37℃條件下15 min，80℃高溫滅活Exo I和FastAP酶15 min。根據ABI公司（美國）提供的SnaPshot試劑盒，用延伸引物進行延伸反應，使用ABI公司的PRISM 3730測序儀進行基因分型。

表1 EST序列的基因注釋信息和SNP位置Tab.1 Gene annotation of EST sequences and positions of each SNP

1.4 大口黑鱸“優鱸1號”群體的遺傳多樣性分析

采用 PopGene 32（Version 1.31）軟件（http：／／www.ualberta.ca／～fyeh／fyeh／）計算哈迪-溫伯 格 平 衡 （Hardy-Weinberg equiliberum，HWE）、有效等位基因數（N e）、觀測雜合度（H o）和期望雜合度（H e）。采用PIC-Calc0.6軟件，依據等位基因頻率計算各個SNP標記的多態信息含量（polymorphism information content，PIC）。

1.5 SNP標記與性狀的關聯分析

用SPSS 19.0軟件一般線性模型（general linearmodel）分析各個基因型與大口黑鱸生長性狀之間的相關性。統計分析模型為Yij＝μ+Bi+eij。其中：Yij為某個性狀第i個標記第j個個體上的觀測值；μ為實驗觀測所有個體的平均值（即總體平均值）；Bi為第i個標記的效應值；eij為對應于觀察值的隨機誤差效應值［12］。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數據及SNP檢測

大口黑鱸快長組和慢長組肌肉組織樣品RNA經深度測序分別獲得5 406萬和5 474萬reads，經組裝后分別獲得 84 602和 88 329 contigs，contig的平均長度分別為400 bp和418 bp。將獲得的測序數據上傳到 NCBI數據上，登錄號為 SRA436296。Q20值大于98.51%，表明測序質量較高。用RNA-seq技術在大口黑鱸快長組和慢長組中分別檢測到15 273和17 376個SNP標記，其中轉換位點分別為9 720和11 085個，顛換位點分別為5 553和6 291個。A、C、G、T 4種類型堿基發生單核苷酸變異的數目介于1 057和5 573之間（表2）。6種單核苷酸變異中以C／T和A／G發生頻率最高，均大于30%，而其它4種單核苷酸變異 A／C、G／T、C／G、A／T發生頻率均在10%以下（表2）。

2.2 SNP標記有效性檢測及在群體中的遺傳特征分析

為驗證轉錄組數據庫中EST-SNP標記的有效性，挑選出75個SNP標記在60個極端樣本中進行SnaPshot分型，結果顯示：37個SNP標記可成功分型，準確率為49.3%。部分SNP標記的堿基突變類型和遺傳參數的統計結果見表3。各標記的遺傳多態信息含量（PIC）介于0.287和0.375之間，根據PIC值介于0.25～0.50之間為中度多態，可知所有標記都屬于中度多態位點。所有標記的平均有效等位基因數（Ne）、平均觀測雜合度（Ho）和平均期望雜合度（He）分別為1.891、0.459和0.467，表明大口黑鱸“優鱸 1號”群體的遺傳多樣性較豐富。Chi-square檢驗分析表明，4個位點（CL1328.Contig1_All-3028、CL1115.Contig2_All-1357、Unigene14288_All-228、CL1339.Contig2_All-844）的基因型頻率分布偏離Hardy-Weinberg定律（P＜0.05），而其余位點均符合Hardy-Weinberg定律。

表2 大口黑鱸快長組和慢長組中的SNPs分布Tab.2 Distribution of SNPs in fast-grow ing and slow-grow ing group

表3 10個SNPs在大口黑鱸“優鱸1號”群體中的遺傳多態性Tab.3 Genetic variability of 10 SNPs in Youlu No.1 largemouth bass population

2.3 SNP標記與生長性狀的關聯分析

37個SNP標記中有10個標記在極端群體與大口黑鱸生長性狀中存在潛在相關性，進一步在大群體中驗證這些SNP標記與生長性狀之間相關性（表4），結果發現，10個SNP標記在群體中均存在3種基因型，以所處堿基對表示基因型類型（表4），如 CL1452.Contig9_All-847標記屬于C／T突變，存在CC和TT純合基因型，以及CT雜合基因型。CL1452.Contig9_All-847標記CC基因型個體在體質量、全長和尾柄長3個性狀的均值都顯著高于TT基因型個體（P＜0.05），CC型個體在體高、頭長上的均值都比TT型的均值高，但差異未達到顯著水平（P＞0.05）。其它位點不同基因型個體間的生長性狀均不存在顯著差異（P＞0.05）。

2.4 SNP標記所處的unigene功能注釋

將CL1452.Contig9_All對應的序列在NCBI在線數據庫中進行BLASTn分析，結果發現該序列與Rab-interacting lysosomal protein（RILP）相似度最高，且該基因序列中的 SNP標記位于3′UTR，不編碼蛋白質。其它unigene序列所注釋的基因名稱見表1。

3 討論

3.1 EST-SNP標記開發

大口黑鱸是我國重要的經濟淡水養殖品種之一，就目前研究來看，其分子標記以微衛星、AFLP和RAPD標記為主，只有少數SNP標記被報道［13］。SNP是基因組中冗余度低而覆蓋度最高的變異，具有便于高通量開發、快速分型等優點，廣泛用于構建高密度遺傳連鎖圖譜和發掘QTL和經濟性狀相關基因［14］。目前利用基因組測序可以大規模開發SNP標記，但是這種方式成本很高，而采用高通量轉錄組測序既可快速獲得大量準確序列信息，又可獲得大量SNP標記，大大降低了成本［15］。本研究中利用轉錄組測序得到近2×104個大口黑鱸SNP標記，EST序列中平均約2 kb出現1個SNP，明顯低于其它水產動物EST中的 SNP標記平均間距［如大黃魚（Larimichthys crocea）506 bp［16］、櫛 孔 扇 貝（Chlamys farreri）426.5 bp［17］、半 滑 舌 鰨（Cynoglossu semilaevis）491 bp［18］］。這種顯著差異可能與本研究采用了較為嚴格的篩選條件（SNP查找限于至少被5個clean reads覆蓋的unigene，最小等位基因質量即每等位基因累計序列的質量不低于20）有關，此外還受測序深度和精確度影響［15］。SNP統計顯示，6種變異類型中以C／T變異頻率最高（32%），這可能是由于CpG二核苷酸上甲基化的胞嘧啶殘基易自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶引起［19］。本研究選擇75個SNP標記進行驗證，發現37個標記具有多態性，SNP標記的準確性為49.3%，這與在大菱鲆［15］（Scophthalmus maximus，46.7%）、大西洋鱈［20］（Gadusmorhua，74.6%）和鯉［6］（Cyprinus carpio，48%）中標記準確性相近，這也反映了利用RNA-seq技術開發SNP標記是一種有效的技術方法。

3.2 大口黑鱸“優鱸1號”群體遺傳多樣性分析

雜合度反映了遺傳一致程度，而多態信息含量是衡量多態性的指標。當PIC＞0.5時，該基因座為高度多態位點，0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態位點，PIC＜0.25時為低度多態位點［21］。多態信息含量越大，說明該位點的雜合子比例越大，提供的遺傳信息越豐富［22-23］。在本研究中，10個SNP標記都處于中度多態，能夠為評價大口黑鱸遺傳多樣性提供較充分的信息，這些標記都沒有表現出高度多態性，原因在于SNP標記是一種典型的兩等位基因標記［21］。SNP標記雖然不像微衛星標記具有較高的多態性，但它在基因組中的廣泛分布，彌補了其多態性較低的不足［24］。本實驗所獲得的10個SNP標記的平均多態信息含量為0.36，反映了大口黑鱸“優鱸1號”群體具有較豐富的遺傳多樣性，可進一步利用選育手段來提高其生長性能。李镕等［25］采用微衛星標記技術分析得出大口黑鱸第4代選育群體（F4）的平均多態信息含量為0.39。本研究中所用的大口黑鱸“優鱸1號”是第10代選育群體（F10），與F4相比，F10的平均多態信息含量減少了7.6%，這與大黃魚“官井洋優快01”選育品系選育世代的遺傳多樣性指標值隨著選育的進行呈現下降的研究結果相一致［26］。通過人工選育手段對群體基因庫進行高強度選擇會造成群體基因水平上的多樣性在一定程度上降低。F10的遺傳多樣性降低幅度很小，這與本實驗選育過程中每代保持較多數量的繁育親本有關，可以盡可能避免近交引起負面影響。

表4 10個SNP標記不同基因型與生長性狀的相關性分析Tab.4 Correlation analysis between different genotypes for 10 SNP lociand grow th traits

3.3 SNP標記與大口黑鱸生長性狀的相關性

經BLAST比對分析，發現CL1452.Contig9_All-847標記所處的基因序列與RILP-like protein 1相似度最高。RILP是Rab7的一個重要的效應蛋白。RILP和 Rab7相互作用，并通過促進Epidermal growth factor receptor（EGFR）降解負調控EGF激活的Akt信號通路，從而調節細胞的生存、增殖分化和凋亡［27］。目前關于RILP在水產動物中的研究鮮見報道。本研究首次在魚類RILP基因上篩選得到一個與生長性狀相關的SNP標記，該標記的CC基因型個體在體質量、全長上顯著優于TT基因型個體，我們推測RILP基因是與大口黑鱸生長相關的功能基因，對生長性狀發揮調控作用，但在其他品種中該基因對生長的調控作用還有待研究。CL1452.Contig9_All-847標記處于3’非編碼區，不會引起其翻譯的氨基酸發生變化，但非編碼區中的堿基突變可影響mRNA的剪切從而導致蛋白質的功能改變［29］，或與基因組區域中相鄰的重要突變位點連鎖。因此，本研究獲得的與大口黑鱸生長性狀相關的CL1452.Contig9_All-847標記，可作為大口黑鱸分子標記輔助育種研究中的候選標記。

［1］ 劉海涌，李勝杰，白俊杰.大口黑鱸養殖群體和引進群體生長性能的比較分析［J］.水產養殖，2015，36（9）：1-5.LIU H Y，LI S J，BAI J J.Comparison of growth performance between the farmed and introduced population of largemouth bass［J］. Journal of Aquaculture，2015，36（9）：1-5.

［2］ GOMEZ-RAYA L，KLEMETSDALG.Two-stage selection strategies utilizing marker-quantitative trait locus information and individual performance［J］.Journal of Animal Science，1999，77（8）：2008-2018.

［3］ 董 玉，李 琪.刺參SNP標記與生長性狀的關聯分析［J］.海洋湖沼通報，2016（2）：49-58.DONG Y，LIQ.Correlation analysis between snps and growth traits of Apostichopus japonicus［J］.Transactions of Oceanology and Limnology，2016（2）：49-58.

［4］ WANG D G，FAN J B，SIAO C J，et al.Largescale identification，mapping，and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome［J］.Science，1998，280（5366）：1077-1082.

［5］ EMAHAZION T，JOBSM，HOWELLW M，et al.Identification of167 polymorphisms in 88 genes from candidate neurodegeneration pathways［J］.Gene，1999，238（2）：315-324.

［6］ XU J，JI P，ZHAO Z，et al.Genome-wide SNP discovery from transcriptome of four common carp strains［J］.PloSOne，2012，7（10）：e48140.

［7］ SALEM M，VALLEJO R L，LEEDS T D，et al.RNA-Seq identifies SNPmarkers for growth traits in rainbow trout［J］.PloSOne，2012，7（5）：e36264.

［8］ ULLOA P E，RINCóN G，ISLAS-TREJO A，et al.RNA sequencing to study gene expression and SNP variations associated with growth in zebrafish fed a plant protein-based diet［J］.Marine Biotechnology，2015，17（3）：353-363.

［9］ 樊佳佳，白俊杰，李勝杰，等.大口黑鱸“優鱸1號”選育群體肌肉營養成分和品質評價［J］.中國水產科學，2012，19（3）：423-429.FAN J J， BAI J J， LI S J， et al. Nutrient composition and nutritive quality of the muscle of Micropterus salmoides，＂Youlu No.1＂［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2012，19（3）：423-429.

［10］ LI R，YU C，LI Y，et al.SOAP2：an improved ultrafast tool for short read alignment［J］.Bioinformatics，2009，25（15）：1966-1967.

［11］ NIE K，ZHANG Y H，GAN R，et al.Polymorphisms in immune／inflammatory cytokine genes are related to Parkinson’s disease with cognitive impairment in the Han Chinese population［J］.Neuroscience Letters，2013，541（29）：111-115.

［12］ LIX，BAI J，HU Y，et al.Genotypes，haplotypes and diplotypes of IGF-II SNPs and their association with growth traits in largemouth bass（Micropterus salmoides）［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（4）：4359-4365.

［13］ 劉 浩，白俊杰，李勝杰，等.大口黑鱸ghrelin基因SNPs的篩選及與生長性狀關聯性分析［J］.水產學報，2016，40（4）：521-527.LIU H，BAI J J，LI S J，et al.SNPs detection of ghrelin gene and its association with growth traits in largemouth bass（Micropterus salmoides） ［J］.Journal of Fisheries of China，2016，40（4）：521-527.

［14］ FERNáNDEZM E，GOSZCZYNSKID E，LIRóN J P， et al. Comparison of the effectiveness of microsatellites and SNP panels for genetic identification，traceability and assessment of parentage in an inbred Angus herd［J］.Genetics and Molecular Biology，2013，36（2）：185-191.

［15］ 王 婷，黃智慧，馬愛軍，等.基于轉錄組數據的大菱鲆（Scophthalmusmaximus）SNP標記開發及多態性分析［J］.海洋與湖沼，2014，45（6）：1300-1307.WANG T， HUANG Z H， MA A J， et al.Development and polymorphic analysis of SNP markers in Scophthalmus maximus based on transcriptome database［J］. Oceanologia et Limnologia Sinica，2014，45（6）：1300-1307.

［16］ WANG P，XIAO S，HAN Z，etal.SNP discovery in large yellow croaker（Larimichthys crocea）using Roche 454 pyrosequencing sequencing platform［J］.Conservation Genetics Resources，2015，7（4）：777-779.

［17］ 李紀勤，包振民，李 玲，等.櫛孔扇貝EST-SNP標記開發及多態性分析［J］.中國海洋大學學報，2013，43（1）：56-63.LIJQ，BAO Z M，LI L，et al.Development and characterization of EST-SNP in Chlamys farreri［J］.Periodical of Ocean University of China，2013，43（1）：56-63.

［18］ WANG W，YI Q，MA L，et al.Sequencing and characterization of the transcriptome of half-smooth tongue sole（Cynoglossus semilaevis）［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：470.

［19］ 杜瑋南，方福德.單核苷酸多態性的研究進展［J］.中國醫學科學院學報，2000，22（4）：392-394.DUW N，FANG F D.The research development of single nucleotide polymorphism［J］.Acta Academiae Medicinae Sinicae，2000，22（4）：392-394.

［20］ SOPHIE H，BRENT H，TUDOR B，et al.Development of a SNP resource and a genetic linkage map for Atlantic cod（Gadusmorhua）［J］.BMC Genomics，2010，11（1）：191-205.

［21］ BOTSTEIN D，WHITE R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms.［J］.American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314-331.

［22］ 李 莉，孫振興，楊樹德，等.用微衛星標記分析皺紋盤鮑群體的遺傳變異［J］.遺傳，2006，28（12）：1549-1554.LI L，SUN Z X，YANG S D，et al.Analysis of genetic variation of abalone（Haliotis discus hannai）populations with microsatellite markers［J］.Hereditas，2006，28（12）：1549-1554.

［23］ 全迎春，馬冬梅，白俊杰，等.大口黑鱸轉錄組SNPs篩選及其與生長的關聯分析［J］.水生生物學報，2016，40（6）：1128-1134.QUAN Y C，MA D M，BAI J J，et al.SNPs identification in RNA-seq data of largemouth bass（Micropterus salmoides）fed on formulated feed and association analysis with growth trait［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2016，40（6）：1128-1134.

［24］ LIU Z J，CORDES J F.DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics［J］.Aquaculture，2004，238（1）：1-37.

［25］ 李 镕，白俊杰，李勝杰，等.大口黑鱸選育群體遺傳結構的微衛星分析［J］.廣東海洋大學學報，2010，30（3）：11-15.LIR，BAI J J，LI S J，et al.Analysis on genetic structure of selected population of largemouth bass by microsatellite DNA markers［J］.Journal of Guangdong Ocean University，2010，30（3）：11-15.

［26］ 趙廣泰，劉賢德，王志勇，等.大黃魚連續4代選育群體遺傳多樣性與遺傳結構的微衛星分析［J］.水產學報，2010，34（4）：500-507.ZHAO G T，LIU X D，WANG Z Y，et al.Genetic structure and genetic diversity analysis of four consecutive breeding generations of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea）using microsatellite markers［J］.Journal of Fisheries of China，2010，34（4）：500-508.

［27］ WANG T，ZHANG M，MA Z，et al.A role of Rab7 in stabilizing EGFR-Her2 and in sustaining Akt survival signal［J］.Journal of Cellular Physiology，2012，227（6）：2788-2797.