pH 對青蛤的鈣化率和兩種酶活性的影響

蔡 娟，周 凱，盛文權，隋延鳴，來琦芳，陸建學，么宗利，高鵬程

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，鹽堿水域漁業工程技術研究中心，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

水體pH值是水產養殖過程中一個重要的環境因子，也是養殖環境的重要指標之一。pH高低直接影響水生動物的攝食、生長及生理代謝［1］，例如：短期的低 pH暴露會導致厚殼貽貝（Mytilus coruscus）生長速度減緩，能量積累減少［2］，氧化應激增強［3］，免疫水平降低［4］，最終導致厚殼貽貝攝食能力減弱［5］；GUO等［6］研究發現低pH會導致雜色鮑（Haliotis diversicolor）、皺紋盤鮑（H.discus hannai）以及葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）受精率、幼蟲殼長以及擔輪幼蟲和面盤幼蟲等各階段的表態率。然而，目前關于pH對青蛤（Cyclina sinensis）影響的報道甚少。青蛤是一種潮間帶貝類，廣泛的分布在中國、日本、韓國以及南亞各國的沿海灘涂［7］，其適宜鹽度、溫度范圍廣，生長速度快，因此從上世紀80年代開始青蛤已在中國沿海開始人工養殖。近些年，隨著青蛤養殖技術的進一步成熟，內陸鹽堿水青蛤養殖也逐漸展開［8］。在沿海灘涂的青蛤養殖面臨海水酸化的威脅，而在內陸鹽堿水養殖又面臨高pH威脅，因此系統研究pH對青蛤的生理影響意義重大。

貝類體表外包被一層厚厚的石灰質貝殼，在其生長過程中貝殼也不斷地延伸，因此貝類生長過程同時也被看作是一個生物鈣化的過程［9］。海洋鈣化生物的貝殼和骨架主要由CaCO3的兩種晶體：文石和方解石構成，它們不會被海水溶解的原因是由于海水中含有過飽和的 Ca2+和［10］。當水體pH改變時含量隨之變化，這會對貝類鈣化率造成影響。碳酸酐酶（CA）是一種活性中心含有鋅離子的金屬酶，能夠逆向催化CO2生成碳酸氫鹽的水合反應，其在生物鈣化和酸堿平衡方面發揮著重要的作用［11］。此外，環境因子（如pH、溫度、溶氧及鹽度）的改變［1，12-13］會引起生物體內發生氧化應激，為了應對應激生物體會調節體內抗應激相關酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內重要的抗應激酶，它可以將機體內過多的O-2催化生成H2O2和O2，從而起到保護機體的作用［14］。大量研究表明當機體發生氧化應激時體內的超氧化物歧化酶（SOD）活性會有所變化［1，12-13］。因此，本實驗從鈣化、碳酸酐酶（CA）活性和超氧化歧化酶（SOD）活性3個方面來研究pH變化對青蛤的影響，以期為pH波動條件下的青蛤養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗用青蛤購自上海市銅川路水產市場，殼長為（3.5±0.5）cm、濕重為（13.6±1.2）g。將青蛤表面清洗后，移入盛有鹽度15（模擬青蛤養殖棲息地鹽度）人工海水的500 L塑料箱中。暫養期間，溫度保持25℃，持續微充氣，日換水量為1／2，投 喂 25 000 cells· mL-1牟 氏 角 毛 藻（Chaetocerosmueller）和微綠球藻（Nannochloropsis oculata）混合藻液，7 d后，選擇健康、活性強、規格基本一致的個體進行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

本實驗設置 5個 pH梯度：7.4、7.8、8.2、8.6、9.0（其中 pH 8.2為對照組），對高 pH的控制用Na2CO3和NaHCO3不同配比來實現，對低pH的控制通過導入CO2來實現。實驗在50 L塑料箱中進行，每天投喂濃度25 000 cells·mL-1牟氏角毛藻和微綠球藻混合藻液5 L，半個小時后換水1／2。每個pH組設置3個重復，每個重復中50 ind青蛤，實驗共進行7 d，分別在以下時間點進行取樣：0 h、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h。每個實驗箱內隨機取出5 ind青蛤，隨即在準備好的冰盒上進行內臟團、外套膜、鰓等組織的采集。取樣后一部分直接放置于-80℃冰箱中冷凍保存，另一部分按照質量體積比1∶9與0.9%生理鹽水緩沖液混合勻漿，8 000 r·min-1離心后取上清液分裝放置于-80℃冰箱保存。同時，每個實驗容器取出3 ind青蛤轉移入裝有與處理相同pH海水的3 L塑料瓶中密封5 h，密封前后測定瓶內海水的總堿度，實驗結束后解剖稱量青蛤去貝殼后的濕重。

1.2.2 CA酶和SOD酶活性測定方法

CA酶測定在HENRY等［15］ΔpH法基礎上加以改進。將貯存的青蛤組織置于預冷的Tris緩沖液中（甘露醇225 mmol·L-1，蔗糖75 mmol·L-1，Tris 10 mmol·L-1，用 15%磷酸調到 pH 7.4）在冰浴條件下勻漿后取適量的組織勻漿液，用預冷的Tris緩沖液稀釋至8 mL組成反應緩沖體系，震蕩混勻，插入pH電極開始監測反應緩沖體系pH值，待pH穩定后，加入240μL 0℃飽和CO2水溶液，即刻起，記錄下降0.15個pH單位所用的時間（tenz）。酶催化反應的速率要減去不加酶的空白反應速率。酶活性標準單位用μmol CO2（mg·min）-1表示。一個酶活性單位（U）定義為在4℃反應體系重，起始pH值為7.4，添加240μL 0℃飽和CO2水溶液，pH值下降0.15所用的時間（tenz）為空白對照反應時間（t0）的一半時所需的酶量。酶活性單位計算公式：U＝t0·tenz-1。用 ΔpH轉化為 μmol CO2·min-1的方法：用移液槍每次加10μL的0.1 mol·L-1HCl，直到媒介下降0.15單位pH，記錄下所用的HCl量，在反應中 H+∶CO2＝1∶1，從而獲得消耗 CO2的量。

SOD酶測定方法參照南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒羥胺法測定。計算公式：SOD活性（U·mL-1）＝（對照組OD值-測定OD值）÷對照組÷50%×放映稀釋倍數×樣本測試前的稀釋倍數。單位為：U·mgprot-1。

總蛋白含量采用微量酶標法（BCA）測定。計算公式：總蛋白濃度（μg·mL-1）＝（測定 OD值-空白OD值）÷（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（563μg·mL-1）×樣本測試前稀釋倍數。單位為：μg·mL-1。

1.2.3 鈣化率的測定方法

鈣化率的測定方法為堿度異常技術［16］，堿度測定采用酸堿滴定法［17］。鈣化率的計算公式：

G＝（TA1-TA2）×V÷（2×T×M），單位為μmol·（g·h）-1。式中，G代表鈣化率；TA1、TA2代表實驗前后總堿度［單位：μmol·（g·h）-1］，T代表實驗時間（單位：h）；M代表實驗對象質量（單位：g）。堿度的計算公式：

式中，CHCl為滴定鹽酸濃度，（單位：mol·L-1）；VT為消耗鹽酸總體積（單位：mL）；AT為總堿度（單位：mmol·L-1）。

1.3 數據分析與處理

文中數據均使用平均值±標準差（Mean±SD）表示，用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）、Duncan法進行多重比較，顯著性水平設置為P＝0.05。

2 結果與分析

2.1 pH對青蛤鈣化率的影響

如圖 1所示，與對照組 pH 8.2相比，pH 7.4、pH 8.6、pH 9.0 3個處理組鈣化率顯著降低（P＜0.05），而 pH 7.8組相較于對照組鈣化率下降但差異不顯著。這些結果表明，當pH降至7.8時青蛤鈣化效率開始降低，當pH降至7.4時青蛤鈣化顯著地受到抑制。此外，pH上升同樣會抑制青蛤鈣化率，當pH達到時9.0時青蛤鈣化率幾乎為零。

圖1 pH對青蛤鈣化率的影響Fig.1 The effects of pH on the calcification rate in Cyclina sinensis

2.2 pH對青蛤兩種酶（CA、SOD）活性的影響

2.2.1 pH對青蛤內臟團、外套膜、鰓CA酶活性的影響

由圖2可知，在3 h、12 h、1 d、2 d、3 d，與對照組內臟團CA酶活性相比，［d2］pH 7.4組內臟團CA酶活性在各時間點均顯著上升（P＜0.05）；pH 9.0組內臟團CA酶活性在12 h、1 d與對照組內臟團相比有顯著上升（P＜0.05）。其余時間段，各個試驗組與對照組均無顯著性差異。

圖2 pH對青蛤內臟團碳酸酐酶活性的影響Fig.2 The effects of pH on CA enzyme activity in the visceralmass of Cyclina sinensis

由圖3可知，在12 h、1 d pH 7.4組和pH 9.0組與對照組外套膜CA酶活性相比顯著上升（P＜0.05），其余各個時間段各個試驗組與對照組差異均不顯著。

圖3 pH對青蛤外套膜碳酸酐酶活性的影響Fig.3 The effects of pH on CA enzyme activity in themantle of Cyclina sinensis

由圖4可知，與對照組鰓CA酶活性相比，在3 h、12 h、1 d、2 d、3 d時間段中，pH 7.4組鰓 CA酶活性顯著升高（P＜0.05）；而在 12 h、1 d、2 d時間段中，pH 9.0組鰓CA酶活性顯著升高（P＜0.05）。

圖4 pH對青蛤鰓碳酸酐酶活性的影響Fig.4 The effects of pH on CA enzyme activity in the gill of Cyclina sinensis

2.2.2 pH對青蛤內臟團、外套膜、鰓SOD酶活性的影響

由圖5可知，與對照組內臟團SOD酶活性相比，在12 h和 1 d pH 7.4組、pH 9.0組內臟團SOD酶活性顯著上升（P＜0.05），其余各時間段各組間均無顯著性差異。

圖5 pH對青蛤內臟團SOD酶活性的影響Fig.5 The effects of pH on SOD enzyme activity in the visceralm ass of Cyclina sinensis

由圖6可知，與對照組外套膜SOD酶活性相比，在12 h、1 d兩個時間段 pH 7.4組和 pH 9.0組SOD酶活性出現顯著升高（P＜0.05），其余各個階段各試驗組與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 pH對青蛤外套膜SOD酶活性的影響Fig.6 The effects of pH on SOD enzyme activity in themantle of Cyclina sinensis

由圖7可知，與對照組鰓SOD酶活性相比，在12 h、1 d兩個時間段pH 7.4組和pH 9.0組鰓SOD酶活性出現顯著升高（P＜0.05），其余各個階段各試驗組與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 pH對青蛤鰓超氧化歧化酶活性的影響Fig.7 The effects of pH on SOD enzyme activity in the gill of Cyclina sinensis

3 討論

3.1 pH對青蛤鈣化率的影響

本實驗結果表明，pH改變后青蛤鈣化率也隨之變化，當pH降至7.8時，青蛤鈣化率隨之降低，當pH進一步降低時青蛤鈣化效率進一步出現顯著性下降。相較于pH降低，pH升高對青蛤鈣化影響更為明顯，表現為pH升至9.0時青蛤鈣化率幾乎降至零。目前關于pH降低對貝類鈣化效率影響的研究屢見報道，如櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的鈣化率隨著酸化加劇而降低，當pH下降到7.9時其鈣化率下降33%，當 pH繼續下降至 7.3時鈣化率趨近于0［18］。MILER等［19］研究發現海水pH降低對不同貝類鈣化作用的影響程度不同，pH在7.7～8.1范圍內，美洲牡蠣（C.virginica）幼蟲的貝殼面積減少16%，鈣質在貝殼中所占比例下降了近一半；而近江牡蠣（C.ariakensis）的鈣化活動仍能正常進行。由此可見，pH對貝類鈣化率的影響有一定的種間差異性。當海水吸收了大量CO2，pH下降，導致其中碳酸根含量降低，而海水中鈣離子濃度相對穩定，因此海水中碳酸鈣飽和度Ω降低，直接導致了貝類鈣化效率的降低，本實驗結果也基本反映了這一現象；反之，當海水pH升高時，海水中碳酸根含量升高，碳酸鈣飽和度Ω升高，理論上有利于貝類鈣化效率。［d5］

3.2 不同pH對青蛤兩種酶（CA、SOD）活性的影響

3.2.1 不同pH對青蛤內臟團、外套膜、鰓CA酶活性的影響

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）是一種Zn2+結合金屬酶，催化 CO2水解可逆反應（CO2+H2O?HCO-3+H+），具有廣泛的生物學功能，參與諸多生命活動如酸堿平衡調節［20］、離子運輸［21］、滲透壓調節［22］以及生物礦化［23］等。本研究顯示，當pH在7.8～8.6幅度內變化時，各組織CA活性變化不大，表明遭遇小幅度的pH波動對青蛤的生理影響并不大。3種組織中內臟團CA活性最高，外套膜次之，鰓組織CA酶活性最低。與對照組相比，pH 7.4時青蛤內臟團、鰓組織中CA活性出現差異的時間段是在3 h～3 d，而外套膜CA活性僅僅在12 h～1 d出現差異；在pH 9.0組內臟團CA酶活性出現差異的時間段是在3 h～3 d，持續的時間與pH 7.4組相同，鰓CA酶活性出現差異的時間段是在12 h～2 d，外套膜CA酶活性出現差異的時間段是在12 h～1d，持續時間最短。類似的報道同樣出現在菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）中，VELEZ等［24］發現經歷7 d pH 7.3暴露，菲律賓蛤仔 CA活性顯著地上升之后迅速恢復正常；但是相反的結果出現在長牡蠣（C.gigas）中，MOREIRA等［25］證實，pH 7.3暴露會明顯抑制牡蠣 CA活性。針對這兩種截然不同的結果，筆者推測這可能歸咎于物種生存習性的差異，菲律賓蛤仔和青蛤生活于灘涂中而牡蠣附著于潮間帶巖石上，相較于潮間帶，灘涂環境因子變化更加多樣頻繁，造就了物種更強的適應能力。［d6］目前關于高pH對貝類碳酸酐酶報道甚少，本課題組用高pH環境脅迫凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）發現其鰓在高碳酸鹽堿度脅迫的第1天CA基因表達量上升為對照組的30倍，之后在第2天回落到初始水平［26］。而本次實驗青蛤需要3 d CA的活性才恢復原水平，說明青蛤相較于凡納濱對蝦應對pH變化的機理可能有一定的差別。

3.2.2 pH對青蛤內臟團、外套膜、鰓SOD酶活性的影響

SOD酶是生物體內重要的抗應激因子，其主要作用是清除機體過多的超氧陰離子（O-2）。在生物體內超氧陰離子來源于線粒體代謝副產物［27］，一定量的超氧陰離子可以幫助機體清除凋亡細胞、殺死細菌、維持機體穩定［28］，但當機體受到環境脅迫時（溫度、鹽度、pH等）線粒體代謝會產生過多O-2［29-30］，而過多的O-2會破壞DNA結構，氧化細胞膜給機體帶來一系列的傷害［4］。為了控制體內O-2水平，機體會調節SOD酶活性來清除過多的O-2以保證機體處于健康狀態。在低pH脅迫方面，大量的報道表明，低酸暴露貝類SOD酶活性經歷一個先升高后恢復的過程［1，3］，同樣在本實驗中青蛤經歷pH7.4暴露后鰓、內臟團以及外套膜SOD酶活性都呈現一個先升高后恢復過程。這可能由于青蛤在剛經歷低pH暴露后其機體代謝會產生大量的O-2繼而誘導SOD酶活性提升，隨著時間的延續機體適應了低pH因此代謝過程中產生O-2隨之降低而恢復到正常水平，因此SOD酶活性也恢復至原先的水平。高pH脅迫對貝類的影響目前研究甚少，LIN等［8］指出長期的高pH脅迫會導致青蛤血細胞數目降低，吞噬能力減弱，但對抗應激相關蛋白的研究并無報道。本實驗結果表明，高pH暴露青蛤各組織SOD酶活性同樣會經歷一個先升高后恢復過程，筆者推測其原因與低pH暴露類似。

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