“肽植”固體飲料的體外活性和對斑馬魚肝臟保護作用的評價

賈福懷，韓曉峰，李志軍，馬芙俊，文劍，苑鵬，段盛林*

1(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波，315012) 2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

隨著社會經濟的飛速發展，我國居民的生活習慣和飲食結構發生了深刻變化，不合理膳食引發的多種慢性疾病成為威脅人們健康的重大隱患。我國政府業已認識到營養干預對慢性病的預防與治療有關鍵作用，并期望通過倡導健康生活方式和指導合理飲食結構，預防慢性疾病的發生。“藥食同源”主要是指食物與草藥同一來源，藥食同源亦食亦藥，它不僅可以充饑，還具有營養、保健、防病治病等多種功能[1]。我國具有悠久的“醫食同源”傳統理念和豐富的藥食兩用資源。例如枸杞子富含枸杞多糖，甜菜堿和維生素A，性質溫和，具有益精明目，滋補肝腎的作用[2]；蒲公英則富含多種維生素和礦物質，常用于清熱解毒，利尿消炎；甘草的有效成分為甘草甜素、甘草次酸、甘草苷元、甘草多糖，具有補脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛之功效。

近些年，具有生理活性的肽作為介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物，已經成為藥理和功能保健食品等研究領域的明星[3]。玉米低聚肽是將玉米蛋白經酶解后，通過小肽分離技術而得到的小分子多肽，具有營養豐富，易于吸收，水溶性和穩定性好，不受腸胃環境影響等優點[4]。玉米低聚肽不但具有降血壓、抗疲勞、抗氧化的功能特性，也有研究表明其具有降低甘油三酯和保肝護肝等作用[5]。

斑馬魚(Zebrafish)因其身體兩側的藍白相間條紋類似斑馬而得名，是一種原產于南亞的淡水魚。由于斑馬魚與人類基因的相似度超過80%[6]，同時具有物種穩定，飼養方便，胚胎通透，便于觀察等特點，斑馬魚已經成為疾病模型建立、毒理學評價和藥物篩選等研究領域中的模式動物新星[7]。對乙酰氨基酚臨床上常用于解熱鎮痛，但對肝臟有嚴重的損傷副作用[8]；以對乙酰氨基酚為底物，以存活率、肝臟面積、肝臟明亮度和卵黃囊吸收延遲面積等為評價指標的斑馬魚肝損傷模型研究業已成熟[9]。

本文考察了一款“肽植”固體飲料的體外抗氧化性和促進甘油三酯(TG)代謝的能力，并選用受精后3 d(3dpf)的野生型AB品系斑馬魚，觀察“肽植”固體飲料對對乙酰氨基酚誘發的斑馬魚肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“肽植”固體飲料粉末(由小麥低聚肽1.67%、玉米低聚肽12.50%、甘草提取物0.83%、枸杞子提取物2.50%、蒲公英提取物2.50%、小麥胚芽粉16.67%、麥芽糊精17.5%、綠豆粉20.83%、藕粉25.00%等組成)，寧波養生之家健康科技有限公司提供；蜂王漿，中國農業科學院蜜蜂所提供；紅棗阿膠枸杞粉、捷森蜂蜜脆麥片(德國產)、核桃阿膠粉、普通面粉，均購自超市。陰涼柜避光保存。

福林試劑、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、油酸(oleic acid，OA)、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶、油紅O染色劑，美國Sigma化學公司；DMEM培養基、噻唑蘭(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT)、胰蛋白酶、平衡鹽緩沖液(hank’s balanced salt solution，HBSS)，太和華美(北京)醫藥科技股份有限公司；新西蘭加強型小牛血清，北京北方同正生物技術發展有限公司；無FFA牛血清蛋白(FFA-free bovine serum albumin，BSA)，日本WAKO公司；RIPA細胞裂解液，碧云天生物技術研究所；甘油三脂(triglycerol，TG)試劑盒，南京建成泰浩生物科技有限公司； RU-21(批號25747)，Spirit Sciences USA；4%多聚甲醛，鼎國生物；對乙酰氨基酚(acetaminophen)、N-乙酰半胱氨酸(簡稱NAC)、甲基纖維素，阿拉丁試劑(上海)有限公司；無水乙醇、鐵氰化鉀、FeCl3、三氯乙酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；6孔板，Nest Biotech China。

1.2 儀器與設備

微量移液槍，德國Eppendorf 公司；RE-52A 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，解剖顯微鏡SZX7(帶相機)，日本Olympus公司；生物安全柜，中國濟南鑫貝西生物技術有限公司；37 ℃ CO2培養箱，日本松下公司；pH計、精密電子天平CP214，瑞士Mettler Toledo 公司；熒光顯微鏡AZ100，日本尼康公司；759-紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實業有限公司；KQ-250DE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠；全波長酶標儀，美國熱電集團；高速冷凍離心機，美國貝克曼公司。

1.3 實驗細胞與實驗動物

1.3.1 肝癌細胞株(HepG2)

中國食品發酵工業研究院保存。

1.3.2 斑馬魚

野生型AB品系斑馬魚，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2012-0171(AAALAC)。挑選正常雌雄成魚交配產卵，收集受精卵培養3 d，孵化的幼魚用于實驗。飼養基礎用水為28 ℃，每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導作用為 480～510 μs/cm；pH為 6.9～7.2；硬度為 53.7～71.6 mg/L CaCO3。

1.4 實驗供試液的配制

1.4.1 抗氧化實驗待測液的配制

精密稱取“肽植”固體飲料產品、蜂王漿、脆麥片、普通面粉、紅棗阿膠粉、核桃阿膠粉各24g(固體樣品經機械粉碎，過60 目篩)，分別置于100 mL圓底燒瓶中，加入30 mL乙醇與水混合液(體積比1∶1)，常溫下超聲提取30 min共3次，合并提取液，離心(3 000 r/min，10 min)，取上清溶液，定容到100 mL，即得樣品溶液，濃度為240 mg/mL。

1.4.2 細胞實驗對照組溶液、模型組溶液和樣品溶液的配制

稱取1.0 mg BSA和100 mL無糖無酚紅的DMEM培養基(預熱至50 ℃)于藍蓋瓶中混勻，加入450 mg葡萄糖，待葡萄糖溶解后用0.22 μm過濾器過濾2次，得到的即為25G 1% BSA的對照組溶液。

稱取2.0 mg BSA和200 mL無糖無酚紅的DMEM培養基(預熱至50 ℃)于藍蓋瓶中混勻，然后稱取40.6 mg的油酸鈉、18.6 mg的棕櫚酸鈉(其摩爾比為2∶1)和500 μL蒸餾水于2 mL離心管中，70 ℃水浴加熱，直至其全部溶解且為透明狀態，逐滴加到培養基中超聲混勻，0.22 μm過濾器過濾，再加入360 mg葡萄糖和540 mg果糖，全溶后用0.22 μm過濾器再過濾1次，得到的即為10G 15F 1 mmol/L FFA的模型組溶液。

將“肽植”固體飲料粉過60目篩，制成濃度為5 mg/mL的母液，過0.22 μm濾膜，備用。

所有細胞實驗的受試溶液于-20 ℃保存備用，使用前孵育至37 ℃。

1.4.3 斑馬魚實驗用溶液的配制

肽植固體飲料粉過60目篩，用純水配制成50 mg/mL母液，用養魚用水按需稀釋。

1.5 實驗方法

1.5.1 總還原力的測定

通過預試驗的篩選[10]，分別加入pH 6.6 的PBS 緩沖液1.0 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL、不同質量濃度待測液1.0 mL于試管中，搖勻后置于50 ℃水浴鍋中加熱20 min，待冷卻后再加入1%三氯乙酸2.5 mL并搖勻，離心(3 000 r/min，10 min)，吸取2.0 mL于另一只試管中，并加入蒸餾水5.0 mL 和0.1%三氯化鐵1.0 mL，混勻后靜置10 min，于700 nm 處測定反應體系的OD 值，每組實驗重復3次，繪制總還原能力變化曲線[11]。

1.5.2 DPPH自由基的清除能力的測定

通過預試驗的篩選[12]，分別取5個不同濃度梯度的各個樣品溶液1.0 mL，DPPH自由基溶液1.0 mL，作為A1組，吸光度值為A1；分別取待測液1.0 mL，50%乙醇1.0 mL，作為A2組，吸光度值為A2；DPPH自由基溶液1.0mL，50%乙醇1.0 mL，為A0參比值。測定各個濃度梯度和對比、參比樣品在517 nm波長處的吸光度，每組實驗重復3次。在線性范圍內計算半數有效濃度IC50值(數值越小DPPH自由基的清除能力越強)。

(1)

1.5.3 細胞內TG含量的測定

采用游離脂肪酸(FFA)(油酸與棕櫚酸的混合物，V(油酸)∶V(棕櫚酸)=2∶1)誘導HepG2細胞建立脂肪變性細胞模型[13]。以此模型為研究對象，給予含不同濃度的“肽植”固體飲料的培養基培養24 h，通過MTT法測定細胞活性，篩選受試物的最佳作用濃度。實驗隨機分為模型組(FFA)、正常組(對照，非誘導的正常HepG2細胞)以及不同濃度的藥物組。將孔板內待測細胞用PBS潤洗2次后，加入RIPA裂解液。充分裂解后，用TG試劑盒測定TG含量。結果以對模型組的百分比表示(%)。

1.5.4 對乙酰氨基酚誘發肝損傷保護作用的斑馬魚實驗

根據肝損傷保護最大耐受濃度(MTC)摸索實驗，確定“肽植”固體飲料對肝損傷保護模型斑馬魚的MTC為50 μg/mL，因此實驗濃度設置為：5.6 μg/mL(1/9 MTC)、16.7 μg/mL(1/3 MTC)和50 μg/mL(MTC)。

隨機選取180尾斑馬魚于六孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚，用對乙酰氨基酚誘發斑馬魚肝損傷。分別給予“肽植”固體飲料濃度5.6、16.7和50 μg/mL，陽性對照藥N-乙酰半胱氨酸(以下簡稱NAC)濃度1.6 μg/mL，同時設置正常對照組(養魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔(實驗組)容量為3 mL。“肽植”固體飲料與對乙酰氨基酚共同處理48 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數據，用NIS-Elements D 3.10 高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚肝臟面積(A)、肝臟明亮度平均值(S)和卵黃囊吸收延遲面積(A)，進行定量分析，并統計，統計學處理結果用mean±SE表示。“肽植”固體飲料肝損傷保護作用計算公式如下：

(2)

(3)

(4)

式中:A1～A3、S1～S3、A4～A6分別為正常對照組、模型對照組和實驗組(NAC+“肽植”固體飲料)的肝臟面積、肝臟明亮度和卵黃囊吸收延遲面積。

1.6 數據分析方法

實驗數據采用Origin 8.1 軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析，來判斷顯著性差異，p<0.05代表有顯著性差異，p<0.01,p<0.001代表有極其顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 抗氧化實驗——總還原力

所有樣品隨濃度的增大，其總還原力均呈現增長的趨勢；在各個樣品終點濃度相同的情況下(24 mg/mL)，對照樣品中只有紅棗阿膠粉的總還原力較高(OD=0.20)，與“肽植”固體飲料的總還原力比較接近(OD=0.25)，其中吸光度OD值越大，總還原力越強，見圖1。所有受試樣品中，“肽植”固體飲料的總還原力最強。

圖1 各樣品總還原力對比Fig.1 Comparison on Fe3+ reducing power of different samples

2.2 抗氧化實驗——DPPH自由基清除能力

除蜂王漿和普通面粉以外，受試樣品隨濃度的增大，其DPPH自由基清除率都能達到或接近100%，且在較低濃度范圍內呈現出很好的線性關系。如圖2所示，在線性范圍內計算半數有效率IC50值(IC50數值越小DPPH自由基的清除能力越強)，IC50(“肽植”固體飲料)=2.0 mg/mL， IC50(脆麥片)=6.5 mg/mL，IC50(普通面粉)=69.1 mg/mL，IC50(蜂王漿)=36.6 mg/mL，IC50(紅棗阿膠粉) = 4.8 mg/mL，IC50(核桃阿膠粉)=4.5 mg/mL。所有受試樣品中，“肽植”固體飲料的DPPH自由基清除能力最強。

圖2 DPPH自由基清除能力IC50值Fig.2 Comparison on DPPH free radical scavenging ability of different samples

2.3 細胞內TG含量測定

如圖3所示，采用游離脂肪酸(FFA)誘導HepG2細胞吞噬大量脂肪酸，使得細胞TG分泌提高、胞內TG顯著累積，此模型可以很好地模擬人體肝臟脂質代謝紊亂的狀態。模型組(OA)細胞內TG含量明顯高于正常組(對照)，可以表明HepG2細胞脂肪變性模型造模成功(p<0.001)；同時，各個劑量組細胞內TG含量明顯比模型組低40%～50%(與模型組比較，各濃度組顯著性差異p<0.001)，盡管沒有體現出明顯的劑量依賴，但是仍表明“肽植”固體飲料可以很好地促進細胞內的TG含量達到或接近正常值。

圖3 不同質量濃度“肽植”固體飲料對細胞內TG含量的影響Fig.3 Intracellular TG content in each groups

2.4 “肽植”固體飲料對對乙酰氨基酚誘發的斑馬魚肝損傷的保護作用

由表1、圖3和圖4可知，模型對照組與正常對照組比較，斑馬魚肝臟面積、肝臟明亮度平均值和卵黃囊吸收延遲面積的顯著性差異均為p<0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥NAC 1.6 μg/mL質量濃度組對斑馬魚肝變性有改善作用(改善作用64%，p<0.001)，但是對斑馬魚肝臟萎縮和卵黃囊吸收延遲的改善作用不明顯；“肽植”固體飲料5.6、16.7和50 μg/mL質量濃度組對斑馬魚肝臟變性均有改善作用(低劑量和中劑量組改善作用分別為65%、49%，p<0.001，高劑量組46%，p<0.01)。

表1 “肽植”固體飲料處理后斑馬魚肝臟保護作用(n=10)

注：與模型對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

L-肝臟；Y-卵黃囊圖4 各實驗組斑馬魚典型圖Fig.4 Typical picture of zebrafish of the experiment groups

圖5 “肽植”固體飲料處理后斑馬魚肝損傷改善作用對比圖；與模型對照組比較Fig.5 The protective effect on liver of zebrafish treated by “Taizhi” solid drink注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001 vs control group

3 結論

活性氧能夠引起細胞的抗氧化系統失控，造成氧化脅迫和氧化損傷，而枸杞子中含有的枸杞多糖[14]、類黃酮和枸杞色素[15]等成分已經被證明具有明顯的抗氧化能力；蒲公英和甘草的黃酮類物質也具有較強的清除活性氧的作用[16-17]；另外，玉米低聚肽的體外抗氧化作用同樣得到研究者的證實[18]。“肽植”固體飲料的主要是由枸杞子、蒲公英、甘草和玉米低聚肽等成分研制而成，本文通過抗氧化實驗研究發現，此款固體飲料具有很好的抗氧化能力，能夠清除人體體內的自由基，起到抗老化和保護器官的作用。GOMEZ-LECHON采用混合脂肪酸V(油酸)∶V(棕櫚酸)=2∶1誘導HepG2細胞內脂肪變性的方法[19]，是一種比較經典的評價脂質代謝作用的模型，本實驗通過對此種評價模型實驗結果的分析，可以表明“肽植”固體飲料具有很好的調控脂質代謝作用，有益于高血脂人群對甘油三酯的調節。除此之外，本文利用新型模式生物斑馬魚，通過對野生型AB品系斑馬魚肝臟形態變化和卵黃囊吸收情況的觀察，可以發現 “肽植”固體飲料對對乙酰氨基酚誘發的斑馬魚肝損傷有保護作用，表現為肝臟變性程度、肝萎縮和卵黃囊吸收延遲均有明顯改善。綜上所述，此款“肽植”固體飲料不僅具有很好的抗氧化作用，而且能夠調控脂質代謝，有利于慢性炎癥類疾病(如糖尿病和心腦血管疾病)的預防和控制；同時，具有保護肝臟的作用，適合非酒精性脂肪肝和慢性肝病人群的輔助調理。

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