加熱處理對大果山楂果肉褐變的影響

張巧，陳振林，潘中田，劉艷，段振華*

1(賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州，542899) 2(賀州學院 食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州，542899)

大果山楂由小果南山楂經過選育嫁接而成，是我國特有的藥果兼用樹種，在廣西地區多有種植。與普通山楂相比，大果山楂果粒大，最大可達300 g左右；總酚、黃酮含量優于小果山楂，營養豐富；果皮為青色，果肉白色，水分足，口感較好[1-2]。大果山楂含有黃酮和花青苷兩大類酚類物質，具有降血脂、降血糖、抑菌、抗腫瘤、防治心血管疾病的功效[3-5]。

本研究從酶促褐變、美拉德反應和抗壞血酸氧化反應3個方面考察了大果山楂的褐變機理，為抑制大果山楂的褐變提供理論依據，進而提高山楂的加工品質及儲運性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂，從賀州市水果店購買；聚乙烯吡咯烷酮：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；福林酚試劑：分析純，北京索萊寶科技有限公司；愈創木酚、鄰苯二酚、抗壞血酸、3,5-二硝基水楊酸、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

722N分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機，Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大果山楂加熱處理

選取新鮮山楂一個，清洗干凈，去核，均勻切塊，每塊質量約5 g，分別在煮沸的去離子水中加熱0、0.5、1、1.5、2 min，立即置于冰水中冷卻。

1.3.2 山楂褐變度的測定[6]

將加熱后的山楂塊分別研磨均勻，4 000 r/min離心20 min，取上清1.0 mL，加1.0 mL的體積分數95%乙醇，搖勻，420 nm處比色。

1.3.3 山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的測定

取加熱處理后的山楂2 g，加入8 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH 6.5、1%的聚乙烯聚吡咯烷酮)，冰水中研磨成漿，4 ℃下避光浸提2 h，離心，上清液測定酶活。

多酚氧化酶活性的測定采用鄰苯二酚法[4]。反應體系為磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 6.5)0.5 mL，0.1 mol/L鄰苯二酚1.5 mL，酶液0.15 mL，420 nm處比色，以每分鐘OD值變化0.01作為1個酶活力單位。

過氧化物酶活性的測定采用愈創木酚[5]。反應體系為0.05 mol/L的愈創木酚1.5 mL，2%的H2O20.5 mL，酶液0.5 ml，470 nm處比色，以每分鐘OD值變化0.01作為1個酶活力單位。

1.3.4 山楂總酚、黃酮含量的測定

取加熱后的山楂2 g，加入8 mL體積分數80%甲醇溶液進行研磨，室溫下提取20 min，4 000 r/min離心10 min，將分離后的沉淀重復上述提取過程1次，合并上清液，測定總酚、黃酮含量。

總酚含量的測定采用福林試劑法[6]。在離心管中分別加入一定量的樣品溶液，加水補足至4.0 mL后搖勻。然后依次加入福林酚試劑0.25 mL、質量分數20%Na2CO3溶液0.75 mL。75 ℃保溫15 min，760 nm處比色。

黃酮含量的測定參照李維莉等方法[7]。吸取一定量的樣品溶液，加入質量分數5%NaNO2溶液0.3 mL，質量分數10%的Al(NO3)30.3 mL，6 min后加入質量分數4%NaOH溶液4 mL，體積分數95%乙醇溶液補充至10 mL，靜置15 min，510 nm處比色。

1.3.5 山楂花青苷含量的測定

參照文獻[8-9]并稍作修改。加熱后的山楂2 g，用6 mL的酸性乙醇[V(體積分數80%乙醇)∶V(1.25 mol/L HCL)=85∶15]60 ℃避光浸提3 h，535 nm處比色。

1.3.6 山楂抗壞血酸含量的測定

參照文獻[10]并稍作修改。加熱2 min的山楂塊2 g，分別在空氣中放置0、3、6、12、18 h，加入4 mL的體積分數1%HCl，研磨均勻，離心，取上清液測定抗壞血酸含量。

在試管中加入一定量的樣品溶液，再加入50mmol/L的FeCl3120 μL，5 mmol/L的K3Fe(CN)60.5 mL，補水至5 mL，40 ℃反應12 min，698 nm處比色。

1.3.7 山楂還原糖含量的測定

采用3,5-二硝基水楊酸法[11]。加熱后的山楂2 g，加6 mL的去離子水，50 ℃浸提15 min，離心，取上清液測定還原糖含量。

在1 mL的稀釋上清液，加1 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水中準確加熱5 min，流水冷卻后補水至10 mL，540 nm處比色。

1 結果與分析

1.2.1 加熱時間對山楂褐變度的影響

褐變度是最能直接反映大果山楂果肉褐變程度的指標。將山楂在沸水中加熱0、0.5、1、1.5和2 min，山楂果肉的褐變度如圖1所示。未經沸水加熱的山楂塊，研磨后的褐變度吸光值達到0.727，褐變非常嚴重。隨著沸水加熱時間的增加，山楂褐變度明顯降低，且褐變度下降速率是先快后慢。這是由于沸水加熱能有效降低山楂果肉中與褐變相關酶的活力，從而對山楂褐變有一定的抑制作用。在一定時間范圍內，加熱時間越長，酶促褐變程度越低。因而，在食品工業生產中，加熱和燙漂是抑制酶促褐變的常用方法[12]。

圖1 不同加熱時間對山楂褐變度的影響Fig.1 Effect of heating time on browning degree of Malus domeri (Bois) Chev.

1.2.2 加熱時間對山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的影響

果蔬酶促褐變與多酚氧化酶、過氧化物酶活力密切相關[14]。在沸水中加熱不同時間，山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的變化情況如圖2所示。

圖2 不同加熱時間對山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的影響Fig.2 Effect of heating time on polyphenol oxidase and peroxidase activity of Malus domeri (Bois) Chev.

隨著加熱時間的延長，山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性明顯降低，且山楂過氧化物酶比多酚氧化酶活性下降得更快，沸水加熱1.5 min，過氧化物酶完全失活，加熱2 min，多酚氧化酶也幾乎完全失活。山楂多酚氧化酶、過氧化物酶的活性與山楂褐變度呈正相關關系。加熱時間越長，酶活性越低，山楂褐變程度也越低。由于沸水加熱對山楂營養成分有一定的損失，且容易造成山楂的失重[15]，考慮2 min作為大果山楂的滅酶時間。

1.2.3 加熱時間對山楂總酚、黃酮及花青苷含量的影響

黃酮和花青苷是山楂中最具代表性的酚類物質。當山楂被切開后，果肉與空氣接觸，山楂中的酚類物質在酶的作用下氧化成醌，進而聚合形成褐色素，因而酚類物質是酶促褐變反應的作用底物[16-17]。山楂在沸水中加熱不同時間，總酚和黃酮及花青苷含量的變化如圖3所示。

圖3 不同加熱時間對山楂總酚、黃酮及花青苷含量的影響Fig.3 Effect of heating time on phenols, flavone and anthocyanin content of Malus domeri (Bois) Chev.

由圖3-(a)可知，沸水加熱時間越長，總酚含量明顯越多，總酚含量與山楂褐變度呈負相關關系。原因在于未經加熱處理的山楂塊，短時間內的褐變使得山楂總酚含量迅速下降，因而總酚含量較低；而經沸水加熱一定時間的山楂塊，山楂中的酚酶活性降低，酶促褐變反應受到一定的抑制，總酚含量反而較高。此外，山楂黃酮含量的變化趨勢與總酚相似，隨著加熱時間的增加，黃酮含量越多，原因很可能是山楂中的酚酶主要作用于黃酮類物質，從而進行酶促反應，因而加熱時間增加，酚酶活力減弱，黃酮參與的酶促褐變受到抑制，黃酮化合物含量較多。與此同時，隨著沸水加熱時間的增加，山楂花青苷含量的變化如圖3-(b)所示。與未加熱處理的山楂相比，加熱山楂的花青苷含量有少量的降低。原因很可能是煮沸能增加山楂色素的溶解度，因而隨煮沸時間的增長，山楂中的花青苷含量稍微減少。

1.2.4 滅酶后山楂褐變度的變化

根據1.2.2的實驗結果，將切塊后的山楂在沸水中加熱2 min后，山楂多酚氧化酶、過氧化物酶失去活性。滅酶后的山楂塊在室溫存放過程中的褐變度變化情況如圖4所示。

圖4 加熱后山楂在不同保存時間下的褐變度變化Fig.4 Browning degree in Malus domeri (Bois) Chev. of enzyme inactivation with different storage time

山楂塊分別存放0、3、6、12、18 h，褐變度吸光值變化不顯著。經過加熱滅酶處理后，酶促褐變反應受到完全抑制，此時山楂塊的褐變度不隨時間發生變化，間接說明山楂快幾乎不發生非酶促褐變。

1.2.5 滅酶后山楂抗壞血酸和還原糖含量的變化

將山楂塊在沸水中加熱2 min后存放，此時酶促褐變完全受到抑制。山楂中的抗壞血酸、還原糖含量變化情況如圖5所示。

圖5 加熱后山楂保存不同時間下的抗壞血酸、還原糖含量的變化Fig.5 Ascorbic acid and reducing sugars content in Malus domeri (Bois) Chev. of enzyme inactivation with different storage time

山楂塊分別存放0、3、6、12、18 h，山楂中的抗壞血酸、還原糖含量不發生顯著變化，這與1.2.4山楂褐變度的變化結果一致，說明大果山楂經滅酶后在保存過程中幾乎不發生抗壞血酸氧化反應和美拉德反應，進一步說明大果山楂的褐變與非酶促褐變無關。

2 結論

在一定時間范圍內，沸水加熱時間越長，大果山楂果肉的褐變度越低。究其原因，是由于加熱導致山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性降低，從而抑制了酶促褐變反應。加熱時間增長，山楂褐變程度降低，總酚、黃酮含量較未加熱山楂高，花青甘含量有少量的減少。將山楂塊沸水加熱2 min，多酚氧化酶、過氧化物酶基本失去活性，滅酶后山楂塊在存放過程中的褐變度、抗壞血酸和還原糖含量不發生顯著變化。可以得出結論：大果山楂果肉的褐變是由酶促褐變引起的，與非酶促褐變無關。因此，在今后對大果山楂果肉進行褐變抑制研究時，應重點考慮在不損失山楂營養成分的前提下抑制酶活性，從而為解決大果山楂果肉嚴重褐變這一難題提供一定的參考依據。

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