基于反轉錄-環介導等溫擴增技術檢測金黃色葡萄球菌

梁玉林，劉秀，周振森，周鵬飛，尹建軍

(中國食品發酵工業研究院，北京， 100015)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是革蘭氏陽性菌，是常見的食源性致病菌之一。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，食品受污染的機會很多，常見受其污染的食品有肉、奶、魚、蛋類及其制品等。進食污染食品會引起食物中毒及肺炎、心包炎、敗血癥等疾病[3-5]。據美國疾病控制中心報告，在全球范圍內由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。因此，開發一種快速、靈敏、準確的方法來檢測金黃色葡萄球菌對食品風險監控工作至關重要。

目前對金黃色葡萄球菌的檢測主要是產致病性毒素金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的檢測，通常采用細菌的分離培養、染色觀察、血漿凝固酶試驗、氧化酶試驗和耐藥性檢測等，這些方法操作繁瑣，檢測時間長，靈敏性不高，不能滿足當前快速檢測需求[6]。近年來以抗原抗體反應為基礎的免疫學方法和以核酸為基礎的分子生物學技術以其準確性、快速性逐漸成為致病菌檢測方法的發展方向[7-8]。酶聯免疫(ELISA)法是免疫學中最常用的方法，SCHOTTE等[9]報道過一種改良ELISA方法，能夠在15 min內檢測500 pg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素。但該方法所用試劑選擇性高，價格昂貴，易受環境、時間、溫度等條件影響。以聚合酶鏈反應(PCR)為代表的變溫核酸擴增方法最早在國外被應用于致病菌檢測，WILSON等[10]采用該方法8 h內可檢出人工污染脫脂乳中金黃色葡萄球菌腸毒素B和C1，對靶DNA檢測限達到1 fg。該方法雖然敏感、準確、快速，但需要昂貴的的儀器設備，對檢測人員有較高的技術要求，限制了這些方法普及和推廣[11-12]。環介導等溫擴增(LAMP)技術是日本學者NOTOMI等[13]在2000年發明的一種全新的核酸體外擴增新技術。LAMP技術具有靈敏度高、特異性強、速度快和設備簡單等優點[14-16]。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于PCR。因DNA在死菌中不易降解，傳統的以DNA為檢測模板進行LAMP反應，可能會檢出死菌DNA而造成假陽性的后果[17-18]。而RNA在死菌中易降解，以RNA為檢測模板進行反轉錄-環介導等溫擴增(reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)能夠避免假陽性的發生。通過選取金黃色葡萄球菌特異性保守nuc基因并設計引物[19-21]，構建了檢測該靶基因的實時熒光RT-LAMP技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌等26株細菌均為本實驗室保存；溶菌酶，天根生物科技公司；RNeasy Minikit，QIAGEN公司；Isothermal Master Mix(IMM)，英國OptiGene Limited公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；平板計數瓊脂(PCA)，瓊脂糖凝膠，北京路橋技術股份有限公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit，寶生物工程(大連)有限公司；Trans DNA MarkerⅡ，全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

微量移液器，德國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋(SX-700)，日本TOMY公司；精密天平(CPA323S)，德國Sartorius公司；超純水儀(Mili-Q Advantage A10)，德國默克公司；離心機( 5804R型，5424型)，德國Eppendorf公司；超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop)，英國柏點公司；GenieⅢ，英國OptiGene Limited公司；電泳儀(JY-300C)，北京君意儀器公司；凝膠成像儀，法國VILBER公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據GenBank中的nuc基因(GenBank Accession BA000018.3)的序列，利用LAMP Primer Explorer 4在線軟件(http://primer explorer.jp/elamp4.0.0/index.htm l)設計5組引物，每組引物分別包括外引物F3、B3，內引物FIP、BIP和環引物LoopF，設計完成后委托北京六合華大基因科技有限公司合成。對設計的引物進行初步篩選，避免引物間出現非特異性擴增。

1.3.2 純培養細菌RNA提取

在平板上取金黃色葡萄球菌單菌落接入LB液體培養基中，培養12 h到對數期。取1 mL菌液5 000g離心10 min，輕輕倒掉液體。向沉淀加入10 μL蛋白酶K，100 μL TE(含終質量濃度15 mg/mL溶菌酶)，充分混勻沉淀，在室溫下反應30 min，后續步驟嚴格按照RNeasy Mini kit操作步驟提取。

1.3.3 RT-LAMP和RT-PCR反應

經優化后在12.5 μL體系中，包括7.5 μL IMM、3.5 μL混合引物(外引物、內引物和環引物含量分別為2.5 pmol、10 pmol和5 pmol)、1.5 μL模板。RT-LAMP反應溫度65 ℃，反應時間30～60 min。

RT-PCR擴增引物nuc-F：5′-GCCCAATTCGTTATGACAGAATACT-3′，nuc-R：5′-CAAGTCGACCAGCTTGTCTTCGC-3′，擴增產物為694 bp。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit 操作步驟進行反轉錄和PCR擴增反應。

1.3.4 死菌中RNA降解實驗

為驗證死菌中RNA降解情況，我們選取107、106、105、104、103、102、101CFU/mL七個菌液濃度。121 ℃下20 min高壓蒸汽滅菌，放置一段時間，模擬死菌狀態。分別對滅菌前后各濃度梯度的金黃色葡萄球菌菌液進行RNA提取，并進行RT-LAMP反應。

1.3.5 RT-LAMP反應的特異性和靈敏度

提取本實驗室的金黃色葡萄球菌等26株細菌RNA，進行RT-LAMP實驗驗證建立的RT-LAMP方法的特異性。將提取的原菌液總RNA測定濃度后，對總RNA進行稀釋，最后選取2 fg、20 fg、200 fg、2 pg、20 pg、200 pg、2 ng/μL共7個濃度梯度，從各濃度梯度各取1.5 μL作為反應模板進行RT-LAMP實驗檢測純培養金黃色葡萄球菌靈敏度。

1.3.6 RT-LAMP和RT-PCR反應在人工污染脫脂乳樣品中的靈敏度檢測

為保證檢測結果的準確性，經國標GB/T4789.10—2016方法證實試驗所用脫脂乳中不含金黃色葡萄球菌。取25 g脫脂乳置于225 mL滅菌生理鹽水中，制備脫脂乳勻漿。取新鮮培養的12 h細菌，用生理鹽水充分洗滌培養基，10倍梯度系列稀釋，取各稀釋度菌液1 mL加入脫脂乳勻漿中，制備人工污染脫脂乳勻漿，使人工污染脫脂乳勻漿中金黃色葡萄球菌含量達到10-1～105CFU/mL，充分混合，作為人工污染脫脂乳樣品。

取各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品1 mL，提取人工污染脫脂乳樣品中的RNA，同時取不加金黃色葡萄球菌的脫脂乳樣品1 mL作為陰性對照平行進行RNA提取。以提取的RNA為反應模板分別進行RT-LAMP和RT-PCR實驗，并對兩種方法的檢測靈敏度進行比較。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

根據RT-LAMP引物設計原則，共設計了5組金黃色葡萄球菌引物。為驗證所設計引物的穩定性，在未存放過核酸樣品的實驗室中，對5組金黃色葡萄球菌引物進行RT-LAMP陰性擴增實驗。由圖1可以看出，1號、2號和3號引物均發生擴增反應，可以斷定該擴增反應是非特異性的，可能是引物二聚體引起的擴增反應。在加入金黃色葡萄球菌核酸樣品情況下，對5組引物進行RT-LAMP陽性擴增實驗。圖2表明，4號引物RT-LAMP反應出現熒光曲線時間最短且熒光值最高。對比圖1和圖2可知，設計的4號引物無論是在引物穩定性還是在擴增時間、熒光值方面均最佳，因此選取4號引物進行下一步實驗，4號引物序列如表1所示。

圖1 金黃色葡萄球菌引物篩選(不含檢測模板)Fig.1 Staphylococcus aureus primer selection (without detection template)

圖2 金黃色葡萄球菌引物篩選(含檢測模板)Fig.2 Staphylococcus aureus primer selection (with detection template)

表1 金黃色葡萄球菌靶基因引物序列

Table 1 Staphylococcus aureus target gene primer sequence

靶基因引物序列(5'-3')nucF3TTAAGTATAGACAATGGGGAGTB3AGCATCCATCATATATTTAGAGTTGFIPACAACGTCATCACCTGTACTTAATT-TTTATCATGCGATT-GATCGTGBIPCTACATCACCAGAAATTGGTACTGT-GCTACCACCTTCAACATCGLFGTTATTACCACCTTCACGTGCT

2.2 引物退火曲線分析

RT-LAMP擴增反應是否發生一般通過凝膠電泳是否出現梯狀條帶判斷，而該方法并不能完全得出擴增是由于體系中的金黃色葡萄球菌特異性靶基因片段存在的結論。為輔助分辨RT-LAMP擴增產物來源，進一步避免假陽性的發生。根據擴增產物的GC含量不同，退火溫度不同的原理，對引物退火曲線進行分析。如圖3所示，篩選的4號引物在退火溫度為82.5 ℃左右時，對應的退火曲線出現峰值。

圖3 4號引物的退火曲線分析Fig.3 Annealing curve analysis of No.4 primer

2.3 死菌中RNA降解實驗

DNA比較穩定，在死菌中能長時間存在，以DNA為檢測模板的LAMP擴增反應可能會檢出死菌DNA而造成假陽性的后果。而RNA不穩定、易降解，不能在死菌中長時間存在。應用RNeasy Minikit試劑盒對同一濃度的金黃色葡萄球菌分別進行滅菌前后菌液核酸提取，并進行RT-LAMP實驗，驗證死菌中RNA的降解情況。結果表明，以滅菌前金黃色葡萄球菌菌液提取的核酸為檢測模板進行RT-LAMP實驗，其檢測限能達到101CFU/mL(如圖4)。

圖4 活菌RNA檢測Fig.4 RNA detection of viable bacteria

RNeasy Mini kit試劑盒對金黃色葡萄球菌的DNA和RNA均能有效提取，通過DNA消化去除DNA雜質得到純的RNA。RT-LAMP反應靈敏，反應體系的IMM中含有反轉錄酶，可以使反轉錄過程和擴增反應過程同步進行，在該體系中以金黃色葡萄球菌的DNA和RNA為檢測模板均能夠產生擴增反應。以滅菌后菌液提取的核酸為檢測模板進行RT-LAMP實驗，可能由于高濃度的菌液中DNA消化不完全導致檢測模板中含有DNA而檢出107CFU/mL的菌液濃度(如圖5)。因在實際樣品中最大也不會產生超過104CFU/mL的污染量，所以以RNA為檢測模板的RT-LAMP反應能很好的鑒別金黃色葡萄球菌是否處于活菌狀態。

圖5 死菌RNA檢測Fig.5 RNA detection of dead bacteria

2.4 RT-LAMP反應特異性和靈敏度

對金黃色葡萄球菌等26株細菌進行RT-LAMP特異性檢測，只有金黃色葡萄球菌產生熒光擴增反應，其余非金黃色葡萄球菌均未產生熒光擴增反應(如表2)，說明建立的RT-LAMP方法具有較強的菌株特異性。

提取純培養金黃色葡萄球菌總RNA作為反應模板，對模板進行10倍系列稀釋，檢測純培養金黃色葡萄球菌RT-LAMP的反應靈敏度。實驗結果表明，當核酸濃度20 fg/μL該方法仍能特異性檢出(見圖6)，所建立的實時熒光RT-LAMP方法比文獻報道的其他病原菌RT-LAMP反應靈敏度至少要高一個數量級[22]。

2.5 RT-LAMP和RT-PCR反應在人工污染脫脂乳樣品中的靈敏度檢測

將提取的人工污染脫脂乳RNA溶解到50 μL不含RNase的無菌水中，取其中1.5 μL為檢測模板，分別進行RT-LAMP和RT-PCR實驗(見圖7和圖8)。同時取1 mL各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品進行平板菌落計數，記錄人工污染脫脂乳樣品中金黃色葡萄球菌的準確含量。結合平板計數，人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP靈敏度達到23 CFU/mL，換算成脫脂乳含菌量為230 CFU/g，并且30 min內能完成檢測。與此同時，人工污染脫脂乳樣品RT-PCR靈敏度只能達到2.3×103CFU/mL，換算成脫脂乳含菌量為2.3×104CFU/g，比RT-LAMP檢測靈敏度低100倍。為進一步判斷擴增反應是否由于體系中的金黃色葡萄球菌靶基因片段存在而引起，對人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP退火曲線進行分析。如圖9各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP退火曲線特征峰的峰值均出現在82.5 ℃左右，跟RT-LAMP陽性擴增相一致。結果判定各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP的擴增反應均是由于體系中金黃色葡萄球菌靶基因片段存在而引起的。所建立的方法從核酸提取到RT-LAMP反應結束大概只需要1 h左右，大大減少了實驗時間，有望應用于現場快速檢測。

表2 RT-LAMP反應特異性

注：“+”表示有熒光擴增曲線，“-”表示無熒光擴增曲線。

圖6 RT-LAMP反應靈敏度Fig.6 RT-LAMP reaction sensitivity

M-DNA分子質量Marker; NC-陰性對照;1-2.3×105 CFU/mL; 2-2.3×104 CFU/mL;3-2.3×103 CFU/mL;4-2.3×102 CFU/mL;5-23 CFU/mL;6-2 CFU/mL;7-0 CFU/mL圖7 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應靈敏度Fig.7 Artificial contamination skim milk RT-LAMP reaction sensitivity

圖8 人工污染脫脂乳RT-PCR產物電泳Fig.8 Artificial contamination skim milk RT-PCR product electrophoresis

圖9 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應退火曲線Fig.9 Artificial contamination of skim milk RT-LAMP reaction Annealing curve

3 討論

在食品檢測中，由于死菌中DNA的長期存在使得基因水平的檢測方法高估了樣品中的活菌的水平，造成假陽性問題。在活菌檢測方面，前人做了大量工作。CHEN等[23]利用熒光染料疊氮溴化丙錠(PMA)與LAMP技術相結合來區分死菌和活菌。PMA是對DNA有高度親和力的熒光染料，不能透過完整的細胞膜，只能選擇性的透過不完整的死細胞，PMA與死菌DNA結合后使之不能發生擴增反應[24-25]。PMA-LAMP實驗需要對PMA濃度和光照時間進行優化，實驗步驟繁瑣。并且由于PMA對革蘭氏陰性菌和陽性菌作用效果不一樣，而導致PMA對混合菌液作用效果不佳。相比而言RT-LAMP在活菌檢測中具有獨特優勢，以致病菌RNA為檢測模板更能反映樣本中的活菌狀態。RT-LAMP技術在病毒檢測中應用廣泛，在食源性致病菌檢測領域應用較少。本研究將RNA檢測和實時熒光LAMP技術相結合，不但能夠鑒定細菌的死活，而且進一步提高了反應的靈敏度。

金黃色葡萄球菌可以產生一種與凝固酶相關的細胞外耐熱核酸酶，近來文獻報道多以編碼耐熱核酸酶的nuc基因為靶基因設計LAMP引物[26-29]。張璐等[30]在檢測的221株金黃色葡萄球菌中，發現99.09%含有nuc基因。本實驗選取特異性保守nuc基因設計了5組引物，通過對不同組引物進行篩選，構建了基于RNA為檢測模板的實時熒光RT-LAMP技術體系。

綜上所述，本研究建立了簡單、便捷、特異性強、靈敏度高適用于脫脂乳的金黃色葡萄球菌RT-LAMP檢測方法。因受金黃色葡萄球菌污染的食品種類很多，不同食物基質對金黃色葡萄球菌核酸提取干擾情況不同，而實驗只對人工污染脫脂乳樣品進行了檢測，因此后期需要擴大人工污染食品種類并對實際樣品進行檢測，逐步完善或推廣該技術的應用。

[1] 關文英, 史紅, 韓艷青，等. 2013年河北省食品中金黃色葡萄球菌污染狀況調查[J]. 中國食品衛生雜志, 2015，27(S1):18-21.

[2] CHEN J, PARK B. Recent advancements in nanobioassays and nanobiosensors for foodborne pathogenic bacteria detection[J]. Journal of Food Protection, 2016,79(6):1 055-1 069.

[3] JORGENSEN H J, MORK T, HOGASEN H R, et al. EnterotoxigenicStaphylococcusin bluk milk in Norway[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(1): 158-166.

[4] KENNEDY J, BOLTON D J, COWAN C. Food safety and bacterial pathogens: why you should eat in restaurants[C]. Proceedings of an international conference hosted by the 32nd Annual Food science and Technology Research Conference. Ireland Cork: National University of Ireland Cork, 2002: 5.

[5] 宋濤平,邱華麗,王淑娟,等. 金黃色葡萄球菌LAMP可視化快速檢測方法的建立[J]. 食品與機械,2015,31(5):55-58.

[6] 張超楠. 食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法研究[D].長春: 吉林大學,2012.

[7] YAN Cheng-hui, ZHANG Yun, YANG Hang, et al.Combining phagomagnetic separation with immunoassay for specific, fast and sensitive detection ofStaphylococcusaureus[J]. Talanta, 2017, 170:291-297.

[8] ZHANG Hong-wei, MA Lu-yao, MA Lina, et al. Rapid detection of methicillin-resistantStaphylococcusaureusin pork using a nucleic acid-based lateral flow immunoassay[J]. International Journal of Food Microbiology, 2017, 243:64-69.

[9] SCHOTTE U, LANGFEIDT N, PERUSKI AH. Detection ofStaphylococcalenterotoxinB(SEB)by enay me linked immunosorbent assay and by a rapid hand held assay[J]. Clin Lab, 2002, 48(7-8):395-400.

[10] WILSON L G, JAMES E, GILMOUR C. Detection of enterotoxingenicStaphylococcusaureusin dried skimmed milk: use of the polymerse chain reaction for amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genesentBandentC1 and the thermonuclearse genenuc[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1991, 57(6):1 793-1 798.

[11] 顧琳,黃平,宋衍燕,等. PCR檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因[J]. 中國食物與營養,2015,21(2):17-19.

[12] 黃其建, 張進, 李靜,等. 實時熒光PCR直接檢測樣本中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌應用研究[J]. 標記免疫分析與臨床, 2016, 23(2):194-196,222.

[13] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(12): E63.

[14] TOMITA N, MORI Y, KANDA H, et al. Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products[J]. Nat Protoc, 2008, 3(5): 877-882.

[15] SONG Chun-mei, LIU Cheng, WU Shu-yan, et al. Development of a lateral flow colloidal gold immunoassay strip for the simultaneous detection ofShigellaboydiiandEscherichiacoliO157:H7 in bread, milk and jelly samples [J]. Food Control, 2016, 59: 345-351.

[16] MORI Y, KITAO M, TOMITA N, et al. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J]. J BiochemBiophys Methods, 2004, 59(2): 145-157.

[17] 樊粉霞, 闞飆, 閆梅英. 利用RT-LAMP技術鑒別傷寒沙門菌[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2013, 29(7): 682-689.

[18] YU Ying, MA Xiao-yan, ZHANG Wei.Detection ofStaphylococcusaureusin milk using real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification[J]. Advance Journal of Food Science and Technology, 2015, 8(9):678-684.

[19] 胡瑜. 金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的功能鑒定及表達調控[D].上海: 上海交通大學,2013.

[20] 譚國浩, 譚翰清, 程潔萍，等. 熒光PCR方法檢測金黃色葡萄球菌nuc基因及其在消毒監測中的初步應用[J/OL]. 中國消毒學雜志, 2014, 31(5):467-469，472.

[21] 鄧陽, 劉曉晨, 李冰，等. 食源性微生物MRSA及其檢測方法在食品安全中的研究進展[J]. 現代食品科技, 2015, 31(1):259-266.

[22] FAN Fen-xia, WANG Shu-jing, LOU Jing. Establishment of RT-LAMP assay to detectSalmonellatyphiin blood[J]. Disease Surveillance, 2012, 27(4): 325-329.

[23] YANG Hong, WANG Yu, MA Xiao-yan, et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection ofStaphylococcusaureusin food [J]. Eur Food Res Technol, 2011, 232(5): 769-776.

[24] ZHANG Tie, WANG Chun-guang, WEI Xiao-yuan, et al. Loop-mediated isothermal amplification for detection ofStaphylococcusaureusin dairy cow suffering from mastitis [J]. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012,11:1-5.

[25] 胡惠秩, 滿朝新, 董鑫悅.等. PMA-LAMP方法檢測滅菌乳中金黃色葡萄球菌的研究[J]. 食品工業科技, 2012, 33(21):300-304，308.

[26] 趙玥明, 滿朝新, 曲艷艷，等. 環介導等溫擴增技術快速檢測肉中金黃色葡萄球菌[J]. 中國食物與營養, 2016, 22(1): 57-61.

[27] CHEN Si-yi, WANG Fei, BEAULIEU J C, et al. Rapid detection of viableSalmonellaein produce by coupling propidiummonoazide with loop-mediated isothermal amplification [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(12):4 008-4 016.

[28] CAO Xiao, ZHAO Li-chao, YANG Cui-qi, et al. Establishment of PMA-LAMP method for rapid detection ofStaphylococcusaureuswith sublethalinjury[J]. Food Science, 2016, 37(24):149-155.

[29] HU Hui-zhi, MAN Chao-xin, DONG Xin-yue, et al. Detecting of viableStaphylococcusaureusby loop-mediated isothermal amplification coupling with propidium monoazide in dairy products[J]. Science and Technology of Food Industry, 2012, 33(21): 300-302.

[30] 張璐. 金黃色葡萄球菌毒力基因的分布和致病性的研究[D].保定: 河北農業大學,2012.