迷迭香提取物與NaCl協同改善肌原纖維蛋白凝膠特性

賈 娜，謝振峰，李儒仁*，邵俊花，劉登勇，劉裕慧

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）屬于鹽溶性蛋白，是肌肉蛋白質的主要組分，其主要功能特性是能夠熱誘導形成凝膠，從而賦予肉制品尤其是肉糜制品良好的質地與口感。溶解度與MP的乳化凝膠特性緊密相關。在一定離子強度范圍內，溶解度隨離子強度的增加而增加，因此，在肉制品加工中通常加入NaCl以提高離子強度，同時通過斬拌和混合來提高MP的溶解度。有研究表明，一定離子強度范圍內，隨著離子強度的增加，豬肉MP的凝膠強度增大[1]。NaCl濃度為0.6 mol/L時，MP的溶解度較高，能夠形成規則有序的三維凝膠網絡結構，而在低濃度NaCl條件下，大部分MP處于未溶解狀態，不能形成穩定的凝膠結構[2]。

香辛料是肉制品加工中的主要輔料，香辛料的使用一方面可以賦予產品一定的風味，另一方面還能起到抗氧化、抑菌等作用。目前，香辛料提取物在肉制品抑菌、抗氧化方面的研究報道較多。將迷迭香提取物和香蜂花提取物應用于熟豬肉糜制品，可以顯著降低硫代巴比妥酸值和己醛含量，說明二者起到了抑制脂肪氧化的作用[3-4]。作為肉制品加工中兩種主要的輔料，NaCl和香辛料都會對蛋白質的結構和功能特性產生一定的影響；但是，二者究竟如何協同影響MP的結構和功能特性，進而影響肉糜制品的品質，尚不完全清楚。本研究旨在制備含不同濃度NaCl的豬肉MP與迷迭香提取物的混合物，通過測定巰基含量、內源熒光強度、流變特性、凝膠強度、保水性，以探討NaCl濃度和迷迭香提取物二者共同對MP結構和凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三元豬背最長肌購自錦州大潤發超市；迷迭香購自當地藥房。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、磷酸鈉、氯化鎂、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等均為國產分析純；Tris 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

FW-200高速萬能粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；THZ-100B恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；ALPHA 1-2LD plus冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；JYS-A900絞肉機 九陽股份有限公司；T25數顯型均質機、RCT基本型磁力攪拌器 德國IKA集團；PL602-L電子天平 上海速展計量儀器有限公司；970CRT熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；TA-XT Plus型質構分析儀 英國Stable Micro Systems公司；DHR-1流變儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香提取物的制備

參照Zhang Xue等[5]的方法并做適當修改。迷迭香洗凈瀝干，放置45 ℃干燥箱中烘干，用高速萬能粉碎機粉碎，過40 目篩備用。取50 g粉末于1 000 mL帶塞的錐形瓶中，加入體積分數為95%的乙醇400 mL，塞緊瓶塞，置于恒溫培養搖床，55 ℃、110 r/min提取12 h，過濾，濾渣加入200 mL 95%的乙醇重提12 h后過濾，合并濾液，旋轉蒸發儀真空濃縮2 h（55 ℃、0.08 MPa），濃縮液在-50 ℃條件下真空冷凍干燥，真空度為7 Pa。所得提取物在-20 ℃保存備用（迷迭香提取率21.28%、含水率5%）。

1.3.2 提取MP與制備樣品

參照Liu Gang等[6]的方法并略作修改。稱取約500 g左右的豬肉，破碎并加入4 倍體積的提取液（10 mmol/L Na3PO4、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA，pH 7.0），勻漿60 s，3 500 r/min冷凍離心15 min，取沉淀重復上述步驟兩次，最后所得沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，按上述離心條件洗滌沉淀3 次，最后一次離心前用4 層紗布過濾，然后用0.1 mol/L HCl溶液調節pH值至6.0，所得MP于4 ℃冷藏備用。以牛血清白蛋白為標準品，利用雙縮脲法測定MP含量。

配制質量濃度為5 mg/mL和40 mg/mL的MP溶液，分別加入0.01 g/g pro的迷迭香提取物，再向混合物中添加NaCl，使其終濃度分別為0.00、0.15、0.45、0.60 mol/L。配制好MP混合溶液于4 ℃冷藏過夜（12 h），同時以不添加迷迭香提取物的MP為對照，用于后續各項指標的測定。

1.3.3 巰基質量摩爾濃度的測定

參照di Simplicio等[7]的方法并略作改進，取上述5 mg/mL的MP溶液1 mL，加8 mL Tris-甘氨酸溶液溶解，均質后冷凍10 000 r/min離心15 min，除去不溶性蛋白并取上清液4.5 mL，加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，搖勻靜置30 min后，在412 nm波長處測吸光度，以磷酸鹽緩沖溶液為對照。巰基質量摩爾濃度的計算采用摩爾消光系數法，所得巰基質量摩爾濃度以μmol/g pro表示，計算如式（1）所示。

式中：A為吸光度；ε為摩爾消光系數（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數。

1.3.4 內源熒光強度的測定

依據李學鵬等[8]的方法并適當修改。準確量取0.5 mL 5 mg/mL的MP溶液，用pH 7.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1 mg/mL，磁力攪拌2 h，10 000 r/min冷凍離心30 min，用熒光分光光度計測定。參數設置：激發波長為295 nm，波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速率為12 000 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm，靈敏度為3。

1.3.5 MP凝膠的制備

取按照1.3.2節處理好的40 mg/mL的MP溶液15 mL，置于稱量瓶中，密封，放置70 ℃恒溫水浴鍋中，持續水浴加熱30 min，隨后自來水冷卻30 min，凝膠樣品貯存在2～4 ℃的冰箱中備用。測定前將MP凝膠在室溫下放置20 min。

1.3.6 凝膠強度的測定

采用TA-XT Plus型質構分析儀進行測定。將待測樣品與稱量瓶置于平臺，測定參數為：探頭型號選擇P/0.5，下壓距離為凝膠高度的50%，觸發力為5 g，測試前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率2 mm/s。

1.3.7 保水性的測定

參照Kocher等[9]的方法并適當修改。稱取5 g凝膠樣品，置于15 mL離心管中，稱質量記為m2/g，隨后于3 000×g冷凍離心15 min，除去水分后再次稱質量，記為m1/g，離心管質量記為m0/g，保水性按式（2）進行計算。

1.3.8 動態流變特性的測定

取一定量制備好的MP溶液，采用流變儀測定，選用50 mm平板測試，將不同處理條件下的MP乳液均勻涂布于測試平臺，消除氣泡并涂膜硅油密封，測試參數如下：頻率為0.1 Hz，應變2%，夾縫間距為0.5 mm，起始溫度20 ℃，升溫速率1 ℃/min，終止溫度80 ℃，在該參數下測定儲能模量（G’）。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 NaCl濃度和迷迭香提取物對MP結構的影響

圖1 NaCl濃度對內源熒光強度的影響Fig. 1 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on intrinsicぼuorescence intensity of myoベbrillar proteins

蛋白質在天然狀態下有特定的空間結構，蛋白質中的色氨酸大量埋藏于內部的疏水環境，色氨酸內源熒光強度較高，熒光發射波長較短；但是，在部分解折疊情況下，蛋白質熒光強度降低，發射波長發生紅移[10]。由圖1可以看出，添加迷迭香提取物組與對照組的內源熒光強度隨NaCl濃度的增加并未呈現規律性的變化，具體原因有待進一步研究；而當NaCl濃度為0.45 mol/L時，與對照組相比，添加迷迭香提取物組色氨酸發射波長由332 nm紅移至334 nm，內源熒光強度下降。說明加入迷迭香提取物后MP中的部分色氨酸暴露于極性環境中，由此造成三級結構發生改變，其特定空間結構部分解折疊，色氨酸內源熒光強度下降有可能來自于肌球蛋白桿狀尾部的部分解螺旋[11]，也有可能來自于肌球蛋白頭部的結構變化（桿狀尾部對肌球蛋白分子熒光強度的貢獻只占總量的27%）[12-13]，迷迭香提取物引起的MP三級結構改變究竟來自于肌球蛋白的頭部還是桿狀尾部，需要進一步證實。此外，迷迭香提取物中的多酚、萜類[14]還有可能通過“屏蔽效應”影響MP的內源熒光強度，這種效應可以通過“手和手套”模型來解釋（蛋白中部分疏水基團形成“手套”，而多酚通過氫鍵等與蛋白結合形成“手”，可能是這種屏蔽效應導致熒光強度下降[15]），該“屏蔽效應”還有可能體現在迷迭香提取物中的酚類物質等與蛋白結合，吸附于蛋白質表面，可能對蛋白質起一定保護作用，導致熒光強度降低[16]。

2.2 NaCl濃度和迷迭香提取物對巰基質量摩爾濃度的影響

圖2 NaCl濃度和迷迭香提取物對巰基質量摩爾濃度的影響Fig. 2 Effect of NaCl concentration and rosemany extract on sulfhydryl group content

巰基是MP中重要的活性基團，易被氧化形成二硫鍵，引起蛋白質分子間交聯、聚合，進而影響蛋白質的功能特性[17]。從圖2可以看出，當NaCl濃度從0.15 mol/L增加至0.60 mol/L時，加或不加迷迭香提取物的MP的巰基質量摩爾濃度變化不顯著（P＞0.05），說明增加離子強度對MP巰基質量摩爾濃度無顯著影響。當NaCl濃度一定時，與對照組相比，加入迷迭香提取物導致巰基質量摩爾濃度顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于迷迭香提取物中主要成分為鼠尾草酚和鼠尾草酸，二者均含有一個能與巰基結合的位點，因此使得巰基含量下降[18-19]。Prodpran等[20]研究多酚對魚肉MP總巰基含量的影響時，也得到了類似結果，即酚類化合物導致總巰基含量降低，可能是由于巰基和酚羥基之間相互作用形成更穩定的構象。此外，高濃度的綠茶多酚也能與MP巰基通過共價交聯形成巰基-醌加成物，阻礙蛋白質之間形成穩定的二硫鍵[21]。

2.3 NaCl濃度和迷迭香提取物對凝膠強度的影響

圖3 NaCl濃度和迷迭香提取物對凝膠強度的影響Fig. 3 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on gel strength

從圖3可以看出，NaCl濃度在0.00～0.15 mol/L范圍內，MP＋迷迭香組和MP組的凝膠強度變化不顯著（P＞0.05），而當NaCl濃度從0.15 mol/L增加至0.60 mol/L時，兩組的凝膠強度均顯著增加（P＜0.05）。這是由于一定范圍內隨著NaCl濃度的增加，MP與NaCl離子互作形成離子基團雙電子層，降低MP分子之間的靜電相互作用，增加MP分子之間的斥力，水化作用增強，從而改善凝膠特性[22-23]。此外，MP分子之間斥力的增加，導致MP膨脹，持水力增大，這與保水性的結果一致[24]。當NaCl濃度為0.00、0.15 mol/L時，MP＋迷迭香組的凝膠強度與對照組無顯著差異（P＞0.05），其主要原因可能在于MP凝膠特性的充分發揮需要提供足夠的溶解度，NaCl濃度較低時（0.00、0.15 mol/L），MP的溶解度較差。高溶解度狀態下（0.45、0.60 mol/L）迷迭香提取物可以提高MP的凝膠強度，但在不同NaCl濃度條件下呈現出不同的結果，NaCl濃度為0.45 mol/L時，MP＋迷迭香組的凝膠強度顯著高于MP組（P＜0.05），這可能是由于該條件下，迷迭香提取物中含有的多酚類物質很容易形成鄰苯醌或鄰苯半醌，該物質與蛋白中的巰基、氨基等基團發生親核加成反應，使蛋白和酚之間形成C—N或C—S共價鍵[25-28]。NaCl濃度為0.60 mol/L時，MP＋迷迭香組的凝膠強度高于MP組，但差異不顯著（P＞0.05），離子強度的增加可能阻礙了部分蛋白-多酚共價鍵的形成，可見，迷迭香提取物對凝膠強度的顯著增效作用依賴于特定NaCl濃度，具體原因有待進一步研究。

2.4 NaCl濃度和迷迭香提取物對凝膠保水性的影響

圖4 NaCl濃度和迷迭香提取物對保水性的影響Fig. 4 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on waterholding capacity

從圖4可以看出，當NaCl濃度從0.00 mol/L增加至0.15 mol/L時，MP＋迷迭香組和MP組的保水性沒有顯著變化（P＞0.05）；隨著NaCl濃度繼續增加至0.45 mol/L時，兩組的保水性均呈顯著增加趨勢（P＜0.05）；當NaCl濃度繼續增加至0.60 mol/L時，MP組的保水性依舊顯著增加（P＜0.05），而MP＋迷迭香組增加不顯著（P＞0.05）。保留肉品內部的水分有兩個必要條件，首先肉中含有水分存在的空間，其次含有維持水分的作用力。有研究證實，水分在肉中的存留，主要依賴于水分子和蛋白之間的相互作用，如氫鍵、毛細管作用力、色散力等[29]。MP作為肉中的結構蛋白質，為肉中的水分提供空間；蛋白所帶的凈負電荷形成強有力的吸附中心，為保留水分提供作用力。添加適量的NaCl可以顯著提高離子強度，有效改善MP的凝膠能力，使其形成均勻的網狀結構，同時隨著離子強度增加，MP所帶凈負電荷增加；蛋白與蛋白分子之間以及蛋白與水之間的作用增強，使得蛋白空間內持水能力增加，保水性能增強[30-31]。MP＋迷迭香組和對照組相比，NaCl濃度為0.45 mol/L時，MP＋迷迭香組的保水性顯著高于MP組（P＜0.05），其他NaCl濃度下差異不顯著（P＞0.05）。一定離子強度下，添加一定量的迷迭香提取物能夠與MP相互作用，影響蛋白分子間以及蛋白與水之間的作用，使凝膠形成能力增強，從而對持水能力起一定促進作用。此外，酚與蛋白之間的相互作用能夠減小蛋白聚合物鏈間的空隙，從而使凝膠結構增強，持水能力增加[32]。

2.5 NaCl濃度和迷迭香提取物對MP凝膠流變特性的影響

流變特性作為MP凝膠的重要特性，能夠反映凝膠的品質。儲能模量（G’）反映MP凝膠的彈性特征，G’越高，表明形成凝膠的能力越強[2]。從圖5可以看出，當NaCl濃度為0.00、0.15 mol/L時，MP＋迷迭香組和MP組的G’均未呈現典型的“幾”字形曲線，表明在該條件下，MP未能形成穩定的凝膠結構。這是由于低離子強度下，MP未能充分溶解，導致凝膠形成能力弱，G’較低。當NaCl濃度為0.45、0.60 mol/L時，G’從40 ℃開始逐漸增加，到46 ℃時達到峰值，這是由于該區間內肌球蛋白頭部的α-螺旋結構開始解旋，頭部交聯，開始形成凝膠；隨后G’從46 ℃開始下降，是由于肌球蛋白尾部變性展開，蛋白穩定性降低，黏彈性降低；從50 ℃開始，G’一直呈上升趨勢，主要是因為大多數肌球蛋白分子可能已經展開，成為隨機線圈結構，增強了蛋白質之間的交聯，從而產生一個穩定且不可逆的凝膠結構[33-34]。一定NaCl濃度下，尤其當NaCl濃度為0.45 mol/L時，MP＋迷迭香組的G’高于未加提取物的MP組，這可能是由于添加的迷迭香提取物與MP相互作用后產生更多結合位點，形成酰胺鍵，增大了蛋白與酚的交聯密度，導致彈性和黏性增強[35-36]。

圖5 NaCl濃度和迷迭香提取物對MP儲能模量的影響Fig. 5 Effect of NaCl concentration and rosemary extract on storage modulus of myoベbrillar proteins

3 結 論

依賴于特定NaCl濃度（0.45 mol/L），迷迭香提取物可以有效“彌補”減鹽對MP凝膠特性的不利影響。提取物中含有的酚酸、萜類等組分改變了肌球蛋白的三級結構，這種有利的部分解螺旋狀態可以在減鹽條件下有效改善MP的凝膠網絡結構，這是減鹽后凝膠強度、儲能模量和保水性沒有顯著下降的重要原因。研究結果可為尋找新型NaCl替代物提供一定的理論依據。

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