啤酒花廢棄枝葉多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

白姍姍，張瑩瑩，趙 強，劉玉梅*

啤酒花（Humulus lupulus L.）是啤酒釀造過程中不可缺少的原料之一，被譽為“啤酒的靈魂”，同時具有健胃、消食等功效，可用于治療癔病、膀胱炎、肺結核等[1-5]，主要化學成分為樹脂類[6]、揮發油[7-8]、多酚類[9-10]、黃酮類[11]等，其中多酚和黃酮類化合物具有很強的抗菌、抗炎、抗氧化等作用，也是各種植物中的主要抗氧化活性成分[12]。中國啤酒花產量位居世界第3，僅次于美國、德國，新疆則是我國啤酒花最大的產區[13-14]。啤酒花采摘期間會產生大量的廢棄枝葉，對其活性成分的研究和開發對發展新疆的經濟具有重要的意義。前期研究發現，啤酒花廢棄枝葉中含有豐富的營養成分，并具有一定的抗氧化活性[15]，但抗氧化作用的物質基礎尚不明確。因此，對啤酒花廢棄枝葉抗氧化活性成分的深入研究，可以為開發利用啤酒花廢棄枝葉提供理論依據。

本實驗以新疆大面積種植的香型花札一和高酸型花馬可波羅2 個品種的廢棄枝葉為原料，并根據采摘部位將其分為主枝、側枝和葉子，分別以乙醇提取其活性成分，后經氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取得不同極性部位，通過羥自由基（?OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實驗、β-胡蘿卜素-亞油酸法及磷鉬酸法4 個評價體系，研究其醇提取物及不同極性部位的抗氧化能力，結合樣品中多酚及黃酮含量的相關性分析，對啤酒花廢棄枝葉進行綜合分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

札一、馬可波羅啤酒花廢棄枝葉由新疆三寶樂農業科技有限公司提供，實驗室分選為主枝、側枝和葉子3 類樣品，40 ℃烘干、粉碎、過40 目篩，備用。

DPPH 美國Sigma-Aldrich公司；沒食子酸中國藥品生物制品檢定所；蘆丁 北京化學試劑公司；2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-di-tert-butyl-p-cresol，BHT）、β-胡蘿卜素、吐溫40、亞油酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、質量分數30%過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鉬酸銨、氯化鈉、濃硫酸、無水甲醇、無水乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等均為分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-100VED型三頻數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；BS210S型電子天平 德國賽多利斯公司；DHP-420型電熱恒溫培養箱 北京市永光明醫療儀器廠；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；Anke.TGL-16G型離心機上海安亭科學儀器廠；HH-S4型數顯恒溫水浴 江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 啤酒花廢棄枝葉浸膏的提取

取札一、馬可波羅啤酒花的主枝、側枝及葉子（葉子預先以石油醚脫脂），用質量分數5%的NaCl溶液脫蛋白，以料液比1∶30（m/V）加入50%（體積分數，下同）乙醇溶液，超聲波輔助提取10 min后，在60 ℃條件下浸提50 min，重復上述操作2 次，合并濾液，濃縮得浸膏，各提取物的浸膏得率見表1。準確稱取一定量的浸膏，加水分散得乙醇提取物（ethanol extract，EE），再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液分別回收溶劑后，得氯仿萃取物（chloroform extracts，CE）、乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate extracts，EAE）、正丁醇萃取物（n-butanol extracts，NBE）和水相萃取物（water extracts，WE），萃取流程見圖1。將上述各萃取物分別用50%乙醇溶解并定容至25 mL，冷藏，用于后續多酚、黃酮含量的測定及抗氧化實驗（各測試樣品的質量濃度可依據浸膏得率計算）。測試前將樣品恢復至室溫后根據需要進行相應的稀釋處理。

表1 啤酒花廢棄枝葉浸膏得率Table 1 Yields of ethanol extracts from abandoned hop branches and leaves

1.3.2 總多酚含量的測定

采用福林-酚比色法[16-18]，以干燥至恒質量的沒食子酸為標準品，以A760nm對沒食子酸質量濃度（ρ）進行線性回歸，得標準曲線方程為A760nm＝0.011 8ρ-0.053 6，R＝0.997 8，線性范圍為8.86～106.32 mg/L。

1.3.3 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[19-20]，以干燥至恒質量的蘆丁為標準品，以A510nm對蘆丁質量濃度（ρ）作圖，得線性回歸方程A510nm＝15.164 5ρ-0.002 0，R＝0.999 3，線性范圍為8.73～69.82 mg/L。

1.3.4 清除?OH活性測定

采用鄰二氮菲-Fe2＋氧化法評價樣品清除?OH能力[21]，以BHT（0.06～0.24 mg/mL）為對照。

式中：E為?OH清除率/%；A樣是加樣品時溶液的吸光度；A損是以重蒸水代替樣品溶液時溶液的吸光度；A未是以重蒸水代替樣品和質量分數0.01% H2O2時溶液的吸光度。

1.3.5 清除DPPH自由基活性測定

DPPH自由基清除實驗參照文獻[22-23]的方法，以BHT（0.06～0.60 mg/mL）為對照。

式中：D為DPPH自由基清除率/%；A1為加樣品時溶液的吸光度；A0為未加樣品時溶液的吸光度。

1.3.6 β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化活性測定

根據文獻[24]的方法，以BHT（0.10×10-4～0.10 mg/mL）為對照，以抗氧化指數（antioxidant activity index，AAI）的大小來反映抗氧化劑總抗氧化能力的強弱。

式中：A樣t、A空t分別表示120 min時樣品和空白的吸光度；A樣0、A空0分別表示0 min時樣品和空白的吸光度。

1.3.7 磷鉬酸體系抗氧化活性實驗

按文獻[25]方法，以0.75 mg/mL的VC為對照，以抗氧化能力（antioxidant activity，AA）的大小來反映抗氧化劑總抗氧化能力的強弱。

式中：A0和A1分別表示VC和樣品在820 nm波長處的吸光度。

1.4 數據統計分析

所有實驗數據均為3 次重復實驗結果的平均值。采用OriginPro 8.6或SPSS 16.0軟件處理數據，并用ANOVA和鄧肯氏多重差異分析（P＜0.05）。所有實驗數據均表示為。

2 結果與分析

2.1 啤酒花枝葉中多酚、黃酮含量

多酚和黃酮類化合物在自然界中分布廣泛，且具有較強的抗氧化活性。該兩類化合物的極性范圍較寬，可以從不同極性的溶劑中萃取得到。因此，不同極性部位所得到的多酚、黃酮類化合物的種類及含量也會有所差異。札一和馬可波羅啤酒花不同極性部位的多酚、黃酮含量分別見表2、3。

表2 各樣品多酚的含量Table 2 Contents of polyphenols in different solvent extracts

表3 各樣品黃酮的含量Table 3 Contents of ぼavonoids in different solvent extracts

由表2、3可知，啤酒花枝葉中均含有一定量的多酚和黃酮類化合物。札一枝干中多酚、黃酮含量均高于馬可波羅，而葉子中的含量均較低。同一樣品中EAE的多酚、黃酮含量均高于CE、NBE和WE，這與張強等[26]對杜仲葉提取物不同極性部位多酚含量研究的結果一致。不同極性部位相比較發現，EAE的多酚、黃酮含量均顯著高于EE（P＜0.05），札一枝干和馬可波羅主枝的NBE中多酚、黃酮含量也高于EE，表明經不同極性溶劑萃取后多酚、黃酮物質在EAE部位和札一枝干、馬可波羅主枝的NBE部位得到富集。

2.2 啤酒花枝葉提取物對?OH清除活性的比較

由圖2可知，各樣品對?OH均有一定的清除能力，且表現出明顯的量效關系。在枝干中，清除?OH的能力均為EAE最強，WE最弱；而在葉子中，EAE、CE的清除能力最強，NBE次之，但均顯著高于WE。

圖2 各樣品清除?OH能力Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of different solvent extracts

表4 各樣品清除?OH的IC50值Table 4 IC50 for hydroxyl radical scavenging activity

清除?OH的能力通常以50%清除率時的樣品質量濃度，即IC50值來衡量，IC50值越小，樣品抗氧化活性越強。由表4的IC50值可知，對2種啤酒花葉子極性部位提取物而言，除WE對?OH清除能力較差外，其他極性部位對?OH清除能力的差異不顯著（P＞0.05），略低于對照品BHT（IC50值為（0.18±0.01）mg/mL）?？傮w而言，EAE部位清除?OH能力較強，該結論與王春景等[27]研究雞眼草和劉瓊等[28]研究傣藥竹葉蘭的結果類似。

2.3 啤酒花枝葉提取物對DPPH自由基清除作用的比較

圖3 各樣品清除DPPH自由基能力Fig. 3 DPPH radical scavenging activity of different solvent extracts

由圖3可知，各樣品對DPPH自由基均有一定的清除能力。當枝干樣品質量濃度為0～5 mg/mL時，清除率隨質量濃度的增大而增大，超過5 mg/mL時，清除率趨于平緩，說明測試體系內DPPH自由基已基本清除完全。

表5 各樣品清除DPPH自由基的IC50值Table 5 IC50 for DPPH radical scavenging activity

由表5的IC50值可知，樣品枝葉中EAE清除DPPH自由基的能力均最強，主枝中CE最弱，側枝和葉子中WE最弱，且均低于對照組BHT（IC50值為（0.25±0.01）mg/mL）。對同一樣品的同一極性部位而言，枝干部分清除DPPH自由基的能力顯著高于葉子。上述結論與黃一泓等[29]研究藏紅花的結果相似，但在相同的質量濃度下，枝干部分的EAE和NBE清除DPPH自由基能力遠高于藏紅花萃取物。

2.4 啤酒花枝葉提取物在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中總抗氧化能力的比較

圖4 各樣品在β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中的抗氧化能力Fig. 4 Total antioxidant activity in β-carotene-linoleic acid model

由圖4可知，各樣品均有一定的抗氧化能力，當質量濃度為0～3 mg/mL時，AAI值迅速增大，繼續增大質量濃度，AAI值逐漸趨于平緩。樣品總抗氧化能力依次為EAE＞NBE＞CE＞WE，略小于BHT（IC50值為3.82×10-3mg/mL）。

表6 β-胡蘿卜素-亞油酸體系中各樣品IC50值Table 6 IC50 for total antioxidant activity in β-carotene-linoleic acid model

由表6的IC50值可知，枝干中札一各極性部位的抗氧化活性略高于馬可波羅，葉子中則相反；而札一和馬可波羅兩個品種枝干部分的抗氧化活性區別不大。祁英等[30]對新疆紫草不同極性部位總抗氧化活性的研究顯示，當樣品質量濃度為2 mg/mL時，EAE和NBE部位的AAI值分別為98%、28%，此結論與本實驗中EAE的總抗氧化活性接近，但NBE的活性遠小于本實驗的啤酒花枝葉提取物。

2.5 啤酒花枝葉提取物在磷鉬酸體系中總抗氧化能力的比較

圖5 各樣品在磷鉬酸體系中的抗氧化能力Fig. 5 Total antioxidant activity in phosphomolybdenum model

由圖5可知，各樣品抗氧化的AA值隨樣品質量濃度的增大而增大，表現出質量濃度依賴性。樣品主枝和葉子中各部位的抗氧化能力以EAE最強，其次是NBE、CE和WE；側枝中各部位的抗氧化能力依次為EAE、CE、NBE和WE。

表7 磷鉬酸體系中各樣品IC50值Table 7 IC50 in phosphomolybdenum model

由表7可知，磷鉬酸體系中樣品抗氧化能力與β-胡蘿卜素-亞油酸乳化體系的結果類似，枝干中札一各極性部位的抗氧化活性高于馬可波羅，而葉子中相反，且不同極性部位存在顯著差異（P＜0.05）。

由表4～7的數據可知，所有抗氧化體系中，EAE的抗氧化能力均高于EE，與黃酮、多酚含量的研究結果一致，說明多酚、黃酮為其主要的抗氧化活性成分。啤酒花枝葉提取物在β-胡蘿卜素-亞油酸體系的IC50最小，在0.04～0.32 mg/mL之間，磷鉬酸體系最大，達到20.24～143.23 mg/mL。

2.6 啤酒花枝葉不同極性部位多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

大量研究表明，植物活性成分的抗氧化能力可能與其多酚、黃酮的含量有關[18]。為了進一步研究上述提取物的抗氧化活性與多酚、黃酮含量的相關性，對不同極性部位抗氧化的IC50值與多酚、黃酮含量進行統計分析，4 種抗氧化體系與啤酒花主枝、側枝和葉子中的多酚、黃酮含量的相關性分析見表8。

多酚和黃酮含量與抗氧化活性的相關性差異較大。在枝干中，多酚和黃酮含量與抗氧化能力均為極顯著負相關，相關系數在-0.652～-0.917之間（P＜0.01），在葉子提取物中，除多酚含量與?OH清除能力的相關系數為-0.493（顯著相關（P＜0.05）），在其他抗氧化體系中均為極顯著負相關，相關系數在-0.728～-0.934（P＜0.01）之間，說明啤酒花枝葉樣品中的多酚、黃酮為其主要抗氧化成分。多酚和黃酮結構中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結構，使得多酚和黃酮具有較強捕捉自由基的能力和抗氧化活性，并且抗氧化活性強弱與其多酚和黃酮類物質含量的高低、種類、結構有關，這也說明啤酒花枝葉提取物中多酚、黃酮的種類多樣。

3 結 論

札一和馬可波羅啤酒花枝葉提取物中含有多酚、黃酮類化合物，且具有一定的抗氧化能力。因多酚、黃酮類化合物種類多，極性范圍較寬，而經不同溶劑萃取后，EAE的多酚、黃酮含量和抗氧化活性均高于EE，說明啤酒花枝葉提取物主要以極性較低的黃酮苷元類物質為主，經過初步分離后，乙酸乙酯對這些成分有效富集。相關性分析也表明，除個別樣品外，所有抗氧化活性體系與多酚、黃酮含量的相關系數絕對值均大于0.650，說明多酚和黃酮是啤酒花枝葉抗氧化作用的主要物質基礎。而對于啤酒花枝葉的抗氧化成分及其活性的構效關系還有待進一步深入探明。

[1] ZANOLI P, ZAVATTI M. Pharmacognostic and pharmacological profile of Humulus lupulus L.[J]. Journal of Ethnopharmacology,2008, 116(3): 383-396. DOI:10.1016/j.jep.2008.01.011.

[2] 劉玉梅. 啤酒花的化學成分及藥理作用研究進展[J]. 食品科學,2009, 30(23): 521-527. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.23.117.

[3] 王仿, 張霞, 熊杰, 等. 新疆野生啤酒花多酚類物質提取與含量比較[J].食品科學, 2010, 31(6): 36-38.

[4] 方威, 熊晶, 邢瑩瑩, 等. 啤酒花莖葉不同提取部位的體外抗腫瘤活性研究及其化學成分鑒定[J]. 藥學進展, 2009, 33(10): 458-462.DOI:10.3969/j.issn.1001-5094.2009.10.005.

[5] 林柳悅, 蔣益萍, 張巧艷, 等. 啤酒花化學成分和藥理活性研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(10): 1830-1836. DOI:10.19540/j.cnki.cjcmm.20170224.019.

[6] 熊皓平, 何國慶, 陳云龍, 等. 啤酒花有效成分分析[J]. 浙江大學學報(農業與生命科學版), 2005, 31(6): 769-772. DOI:10.3321/j.issn:1008-9209.2005.06.023.

[7] LIGOR M, STANKEVI?IUS M, WENDA-PIESIK A, et al.Comparative gas chromatographic-mass spectrometric evaluation of hop (Humulus lupulus L.) essential oils and extracts obtained using different sample preparation methods[J]. Food Analytical Methods,2013, 7(7): 1433-1442. DOI:10.1007/s12161-013-9767-5.

[8] MONGELLI A, RODOLFI M, GANINO T, et al. Are Humulus lupulus L. ecotypes and cultivars suitable for the cultivation of aromatic hop in Italy? A phytochemical approach[J]. Industrial Crops and Products,2016, 83: 693-700. DOI:org/10.1016/j.indcrop.2015.12.046.

[9] KURUMATANI M, FUJITA R, TAGASHIRA M, et al. Analysis of polyphenols from hop bract region using CCC[J]. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 2005, 28(12/13): 1971-1983. DOI:10.1081/JLC-200063640.

[10] NAGASAKO-AKAZOME Y, HONMA D, TAGASHIRA M, et al.Safety evaluation of polyphenols extracted from hop bracts[J]. Food and Chemical Toxicology, 2007, 45(8): 1383-1392. DOI:10.1016/j.fct.2007.01.019.

[11] 張維庫, 王守寶, 付騁宇, 等. 啤酒花的黃酮類成分[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(10): 1539-1542. DOI:10.4268/cjcmm20131017.

[12] WANG X, YANG L, YANG X, et al. In vitro and in vivo antioxidant and antimutagenic activities of polyphenols extracted from hops(Humulus lupulus L.)[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2014, 94(8): 1693-1700. DOI:10.1002/jsfa.6534.

[13] JOSEF P, VLADIM?R N, ALENA H, et al. Assessment of the genetic diversity of wild hops (Humulus lupulus L.) in Europe using chemical and molecular analyses[J]. Biochemical Systematics and Ecology,2010, 38(2): 136-145. DOI:10.1016/j.bse.2009.12.023.

[14] 韓珍瓊, 李小波. 啤酒花保健飲料的生產工藝研究[J]. 食品工業科技, 2005, 26(3): 131-132; 135. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2005.03.044.

[15] 白姍姍, 劉博奧, 劉玉梅. 啤酒花廢棄枝葉的營養成分及抗氧化活性研究[J]. 釀酒科技, 2016(3): 61-64. DOI:10.13746/j.njkj.2015446.

[16] DUAN X J, ZHANG W W, LI X M, et al. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata[J]. Food Chemistry, 2006, 95(1): 37-43. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.12.015.

[17] DULF F V, VODNAR D C, SOCACIU C. Effects of solid-state fermentation with two ベlamentous fungi on the total phenolic contents,flavonoids, antioxidant activities and lipid fractions of plum fruit(Prunus domestica L.) by-products[J]. Food Chemistry, 2016, 209: 27-36. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.04.016.

[18] HAYOUNI E A, ABEDRABBA M, BOUIX M, et al. The effects of solvents and extraction method on the phenolic contents and biological activities in vitro of Tunisian Quercus coccifera L. and Juniperus phoenicea L. fruit extracts[J]. Food Chemistry, 2007, 105(3): 1126-1134. DOI:10.1016/j.foodchem.2007.02.010.

[19] VIACAVA G E, ROURA S I. Principal component and hierarchical cluster analysis to select natural elicitors for enhancing phytochemical content and antioxidant activity of lettuce sprouts[J].Scientia Horticulturae, 2015, 193: 13-21. DOI:org/10.1016/j.scienta.2015.06.041.

[20] ZIELINSKI A A F, HAMINIUK C W I, ALBERTI A, et al. A comparative study of the phenolic compounds and the in vitro antioxidant activity of different Brazilian teas using multivariate statistical techniques[J]. Food Research International, 2014, 60: 246-254. DOI:0.1016/j.foodres.2013.09.010.

[21] 劉芬, 詹文紅. 白芍總苷體外抗氧化活性研究[J]. 現代藥物與臨床,2015, 30(2): 132-135. DOI:10.7501/j.issn.1674-5515.2015.02.004.

[22] KAEWPIBOON C, LIRDPRAPAMONGKOL K, SRISOMSAP C,et al. Studies of the in vitro cytotoxic, antioxidant, lipase inhibitory and antimicrobial activities of selected Thai medicinal plants[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2012, 12(1): 217-225.DOI:10.1186/1472-6882-12-217.

[23] KOU X, GAO J, XUE Z, et al. Purification and identification of antioxidant peptides from chickpea (Cicer arietinum L.) albumin hydrolysates[J]. LWT-Food Science and Technology, 2013, 50(2):591-598. DOI:10.1016/j.lwt.2012.08.002.

[24] 凌關庭. 抗氧化食品與健康[M]. 北京: 化學工業出版社, 2004:333-334.

[25] 陳南迪, 方妙玉, 吳錫鴻, 等. 不同品種蜂花粉總黃酮含量與抗氧化活性相關性的研究[J]. 食品工業科技, 2013, 34(1): 70-73.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.01.007.

[26] 張強, 蘇印泉, 張京芳. 杜仲葉不同萃取物抗氧化活性比較分析[J].食品科學, 2011, 32(13): 23-27.

[27] 王春景, 胡小梅, 張鼎, 等. 雞眼草抗氧化活性部位的篩選及其黃酮和總酚含量[J]. 中藥材, 2014, 37(5): 868-871. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.05.034.

[28] 劉瓊, 李喬麗, 放茂良, 等. 傣族藥竹葉蘭不同極性部位提取物的抗氧化性研究[J]. 中國農學通報, 2011, 27(14): 77-81.

[29] 黃一泓, 劉雅莉, 武文斌, 等. 藏紅花花瓣體外抗氧化活性部位的篩選與研究[J]. 天然產物研究與開發, 2013, 25(11): 1489-1493; 1567.DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.11.004.

[30] 祁英, 劉玉梅. 新疆紫草不同極性部位的抗氧化活性研究[J]. 中國現代應用藥學, 2013, 30(8): 850-856. DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2013.08.012.