曬干處理對花生過敏原蛋白潛在致敏性的影響

常雪嬌，李 坤，張 英，陳紅兵，吳志華,*

花生是我國主要的油料作物、經濟作物，也是我國的優勢出口農作物，我國花生現種植面積約占世界總種植面積的20%；年產量約有1 500萬 t，占世界總產量的40%，居世界首位[1]。花生在食品行業中有廣泛的應用，但是花生同時也是八大過敏性食物之一[2]，其致敏性也得到了廣泛的關注[3-4]，2010年，在加拿大的一個全國性調查中，花生過敏癥的患病率為0.61%[5]。法國的一項調查結果顯示，花生過敏患者占食物過敏患者總人數的28%[6]。據中國協和醫科大學變態反應科調查，北京地區約有4%的食物過敏患者對花生過敏[7]。花生過敏會產生嚴重的變態反應，而且通常是終身的，只有10%左右的過敏兒童會隨年齡增長產生耐受性[8]。截止2016年，國際免疫學會聯合會已經確認了Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4等17 種花生中的過敏原蛋白[9-11]。其中Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4、Ara h 6屬于主要過敏原，可被高達90%的花生過敏患者識別[12]。

花生富含蛋白質和油脂，在高水分和新陳代謝較強的情況下，很容易變質，由于花生種子后熟期較長，酶活性很強，呼吸過程中放出較多的水汽和熱量，導致花生在種植、收獲、貯藏、生產各個過程中極易受不同生物的侵染。在我國，花生受黃曲霉菌及其毒素的污染尤為嚴重[13-14]。黃曲霉毒素是由黃曲霉等真菌產生的一類具有生物活性的次生代謝產物，是強致癌物，對人類及牲畜健康危害極大，黃曲霉毒素污染嚴重威脅著花生相關食品產業的安全，甚至影響了我國花生產業的發展[15]。干燥作為花生產品加工的重要環節之一，是保證花生品質，防止其霉變的必要手段。花生干燥的方法一般有自然曬干法和機械烘干法。

干燥過程中，花生會發生一系列的生理生化過程，影響過敏原蛋白的組成、結構和性質。已有報道顯示，機械烘干過程中，花生隨著水分的減少，不僅會發生顏色的變化，花生中可溶性蛋白和糖的含量也會減少[16]。在高溫烘烤過程中，花生過敏原蛋白的結構會變得松散，致敏性增強[17]。農戶食用花生則以曬干為主，即直接將收獲的花生莢果攤開晾曬，利用太陽照射和空氣流動減少莢果中的水分，直至花生莢果含水量達到安全貯藏標準[18-19]，曬干后花生中過敏原蛋白含量和組成的變化鮮見報道。

本研究分別從新鮮和曬干處理后的花生籽仁中分離提取花生蛋白，分析花生中的主要過敏原蛋白的數量、結構和性質的變化，探索曬干處理對花生主要過敏原蛋白潛在致敏性的影響，以期為低致敏花生制品的生產提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮花生購自江西省南昌市青山湖市場。

實驗所用人血清購自重慶曼紐艾克科技有限公司，利用來源于10 名花生過敏患者的血清構建了血清池，其特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E水平約為70 IU/mL。

β-巰基乙醇 上海生工生物有限公司；R250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 天津大茂試劑公司；預染蛋白Marker 德國Fermentas公司；二喹啉甲酸（bimcincheninic acid，BCA）蛋白質定量試劑盒 北京天根生化科技有限公司；96孔酶標板美國Corning公司；標記羊抗人IgG二抗、鄰苯二胺 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PB-10型pH計 德國Sartorius公司；FDV型超細粉碎機 北京興時利和科技發展有限公司；RH basic 2 S25型磁力攪拌器 德國IKA公司；Allegra 64R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；BR680型酶標儀、PowerPac3000迷你蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；SQ-GS800掃描儀 北京宇艾奇科技有限公司；J-810型圓二色光譜（circular dichroism，CD）儀 日本JASCO公司；UV WinLab V6紫外-可見分光光度儀 美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 花生曬干處理

選擇成熟度相同、無明顯病蟲害和外觀損傷的新鮮帶殼花生，分別進行去殼曬干和帶殼曬干處理。選擇白天平均溫度為35.0 ℃，平均相對濕度為63.6%的晴朗天氣，參照一般國內花生曬干的方法[19]將花生攤成薄層，在開闊通風的地方暴曬，夜間收回攤涼，連續5 d，花生失水減少質量約37%。

1.3.2 花生樣品脫脂

參照周寧菱[20]的方法進行，將沉淀與上清液的分離方法由離心改為抽濾，具體操作如下：將不處理的新鮮花生和進行不同曬干處理的花生分別剝殼去種皮，采用超細粉碎機在液氮作用下將其粉碎成約100 目的細粉。將花生粉末利用丙酮脫脂（1∶5，m/V；含體積分數為0.07%的β-巰基乙醇），于4 ℃條件下磁力攪拌脫脂2 h，再利用抽濾裝置在通風櫥中抽干，棄濾液，重復脫脂2 次，最后將沉淀置于通風櫥中自然風干得花生脫脂粉，-20 ℃下凍存備用。

1.3.3 花生樣品中蛋白質的定量與定性

1.3.3.1 花生樣品中粗蛋白含量測定

參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[21]，采用凱氏定氮法測定不同花生樣品脫脂粉中粗蛋白含量，將脫脂粉0.1 g、硫酸銅0.5 g、硫酸鉀3.0 g和硫酸一起加熱，進行消化，并用0.1 mol/mL鹽酸標準液滴定。每個樣品做3 次平行，花生的蛋白質轉化系數為5.46[21-22]，將結果折算成新鮮花生中粗蛋白的含量。

1.3.3.2 花生蛋白的提取

參照周寧菱[20]的方法進行。將花生脫脂粉0.8 g與50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）按1∶5（m/V）比例混合，于4 ℃條件下磁力攪拌提取10 h。提取結束后，于4 ℃、9 000 r/min離心15 min，所得上清液即為第1次提取液，將沉淀按照以上步驟重復浸提2 次，獲得第2次和第3次的蛋白提取液，均凍存于-20 ℃保存備用。

1.3.3.3 BCA法測定花生提取液中蛋白質量濃度

參照BCA蛋白質定量試劑盒的說明書，測定花生樣品脫脂粉經3 次提取后所得提取液中蛋白質量濃度，選用標準溶液為2 000 μg/mL BSA溶液，配制一系列質量濃度的標準溶液，質量濃度梯度設置3 個復孔，工作液顯色，在562 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

花生樣品蛋白提取液進行適當稀釋，使質量濃度落于標準曲線范圍內。計算出花生樣品蛋白提取液中花生蛋白的質量濃度，計算脫脂粉中可提取蛋白質量濃度，可提取蛋白質量濃度在總蛋白中所占比值即為蛋白質的提取率。

1.3.3.4 SDS-PAGE定性分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）法分析不同蛋白提取液中蛋白組分的變化。花生樣品蛋白提取液中花生蛋白質量濃度為1 mg/mL，上樣量為10 μL。Marker上樣量為4 μL，選用質量分數為15%分離膠、4%濃縮膠。設定電泳條件分別為恒流12 mA和24 mA，時間分別為30 min和1.5 h。電泳結束后，進行剝膠、染色、脫色等工序。采用SQ-GS800光密度掃描儀，對蛋白電泳凝膠進行圖象采集并進行定性和定量分析。灰度掃描結果為該條帶占該泳道總灰度的百分比，用此百分比和可提取蛋白的含量計算得出花生中該過敏原蛋白的質量濃度。

1.3.4 蛋白質的結構分析

1.3.4.1 蛋白質二級結構分析

為表征蛋白的二級結構變化，參照李坤等[23]的方法，分別對3 種不同處理的蛋白樣品進行色譜檢測，掃描波長范圍為150～250 nm。將得到的數據導入到CD分析網站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.stml）中進行分析，得到各樣品蛋白二級結構成分的含量，獲知不同處理前后α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規卷曲結構的含量變化。

1.3.4.2 蛋白質三級結構分析

將不同處理的花生蛋白樣品用紫外-可見分光光度儀進行紫外檢測，掃描波長范圍為250～350 nm，光譜間隔1 nm。

1.3.5 花生過敏原蛋白潛在致敏性分析

參照Meng Xuanyi等[24]的方法采用間接競爭酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測不同曬干處理后花生過敏原蛋白與IgE的結合能力，并做如下改動：包被蛋白質量濃度10 mg/mL，人血清稀釋倍數為1∶80，二抗稀釋倍數1∶5 000，親和素稀釋倍數為1∶100。按下式計算IgE抑制率。

式中：B為不同曬干處理后競爭蛋白的OD值；B0為無競爭蛋白時的OD值。

1.4 數據統計分析

每次實驗做3 次平行，數據分析采用SPSS統計分析軟件，數據作圖采用Origin軟件。統計顯著性分析用單因素方差分析，以P＜0.05表明具有顯著性差異，以P＜0.01表明具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同曬干處理對花生樣品中粗蛋白含量及可提取性蛋白含量的影響

圖1 曬干處理對新鮮花生中粗蛋白以及可提取性蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of sun-drying on the contents of crude protein and extractable protein in fresh peanut

由圖1可知，去殼曬干處理后花生中粗蛋白含量約為17.94 g/100 g，帶殼曬干處理后花生中粗蛋白含量約為15.43 g/100 g，可知新鮮花生經過去殼曬干處理后，粗蛋白含量略有下降，但與去殼曬干相比沒有顯著性差異，而新鮮花生經帶殼曬干處理后，其中粗蛋白含量有極顯著性下降（P＜0.01），去殼曬干的花生中粗蛋白含量多于帶殼曬干的花生。其原因為，在相同條件曬干時，進行去殼曬干處理的花生干燥失水的速度更快，后熟期更短，影響到植物體內細胞和酶的作用，使其代謝所消耗的蛋白質等營養物質更少，粗蛋白的含量相對帶殼曬干花生更高[25]。這一結論與關于豆科牧草的相關研究結果[26-28]一致，機械加工聯合干燥處理可以加快脫水，減少營養成分的消耗和損失，所以進行去殼曬干處理的花生中粗蛋白含量多于帶殼曬干的花生。

由圖1可以看出，新鮮花生中可提取性蛋白的量最多，曬干處理后的花生中可提取性蛋白的量有減少但變化不大。雖然提取前、后蛋白質含量的檢測方法不同，但凱氏定氮法與BCA法均能準確測定蛋白質含量，兩者的結果是可比的[29-30]。分析蛋白質變化的原因，可能是帶殼曬干花生在后熟期內主要消耗轉移的是非可溶性蛋白。通過計算，求得曬干花生中可溶性蛋白質占總蛋白的百分比增加，其中以帶殼曬干的最高，由于可溶性蛋白質本身能體現代謝的活躍程度[31]，由此可知，帶殼曬干的花生在后熟期內代謝活動更劇烈。

另外，花生蛋白的提取次數對花生蛋白含量的影響研究中發現[32]，在3 次浸提后，大部分蛋白質能被提取出來，再繼續浸提，不僅浪費試劑，而且所用的Tris-HCl提取液有可能造成蛋白質的水解變性[33]，綜合來說浸提次數為3 次效果最好。綜合3 次提取的結果，可以看出花生中蛋白質的提取率均達到了50%，而利用其他方法分離花生蛋白的提取率可高達70%[34]，這是由于研究中為保證花生中的過敏原蛋白不受破壞，采用了較為溫和的Tris-HCl作為浸提液。

2.2 花生提取液中過敏原的組成

圖2 不同曬干處理后花生蛋白SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE patterns of peanut proteins extracted after different drying treatments

由圖2可知，主要過敏原為Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4、Ara h 6。由圖3可知，曬干處理前、后，主要過敏原的含量均發生了變化。其中過敏原Ara h 1含量在曬干處理后極顯著升高，且帶殼曬干后過敏原Ara h 1的含量有顯著性優勢；過敏原Ara h 2、Ara h 3/4在曬干處理后極顯著增加，但不同曬干處理方法之間沒有顯著性差異；過敏原Ara h 6在花生中含量很少，不同處理之間含量雖有變化，但沒有顯著性差異。可以看出花生在曬干過程中后熟作用劇烈[35]，蛋白質仍在不斷合成中，主要過敏原含量有所增加，其中帶殼曬干的花生中過敏原Ara h 1的合成作用比去殼曬干的花生更強。

圖3 曬干處理對花生主要過敏原蛋白含量的影響Fig. 3 Effect of sun-drying on the contents of major allergen proteins in peanut

2.3 曬干處理對花生蛋白結構的影響

圖4 曬干處理對花生蛋白結構的影響Fig. 4 Effect of sun-drying treatment on the structure of peanut proteins

表1 花生蛋白二級結構經不同曬干處理后各構象單元含量變化Table 1 Secondary structure contents of peanut proteins extracted after different drying treatments

蛋白質的CD光譜反映了蛋白質二級結構的信息，由圖4A可以看出，新鮮花生的蛋白CD譜圖在193 nm波長處有一正峰，212 nm波長處有一個負峰，說明新鮮未處理的花生蛋白存在α-螺旋結構，含量為6.1%。去殼曬干處理后，α-螺旋含量增加了109.8%，達到12.8%，而其他3 種構象單元的含量均相應降低，說明去殼曬干處理后花生蛋白變得更加有序。但帶殼曬干處理后，α-螺旋、β-折疊和β-轉角含量都有所降低，而無規卷曲含量有所增加，說明帶殼曬干后花生蛋白變得更加無序。結果表明，不同曬干方式會對花生蛋白的二級結構造成不同的影響。

圖4B顯示了蛋白質分子中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等殘基的紫外吸收，吸收峰約在250～280 nm處[36-37]。經去殼曬干處理后，花生蛋白在250～285 nm波段內紫外吸收強度低于新鮮花生，但在285～350 nm波段內與新鮮花生的紫外吸收強度相差不大；而經帶殼曬干處理后，花生蛋白在250～325 nm波段內比新鮮花生的紫外吸收強度低，在325～350 nm波段內比新鮮花生的紫外吸收強度高。結果表明曬干處理后，蛋白質三級結構都變緊湊，且去殼曬干花生結構更為緊湊。

2.4 曬干處理對花生過敏原蛋白潛在致敏性的影響

圖5 曬干處理對花生過敏原蛋白的IgE結合能力的影響Fig. 5 Effect of sun-drying treatment on IgE-binding capacity of major allergen proteins in peanut

血清IgE結合能力常用于比較花生蛋白的潛在致敏性[36]。競爭抑制率越低，競爭抗原與過敏患者血清的結合能力越弱，即潛在致敏性越低。不同曬干處理后花生蛋白IgE結合能力如圖5所示。經曬干處理后，花生的潛在致敏性顯著增強，而帶殼曬干的花生潛在致敏性最強，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值（0.9 mg/mL）僅為新鮮花生IC50值（3.6 mg/mL）的25%。與烘烤花生的研究結果一致[16]，干燥處理會使花生過敏原蛋白的潛在致敏性增強[17]。這也與過敏原蛋白的數量有關，曬干過程中，主要過敏原蛋白含量顯著增加，花生過敏原蛋白潛在致敏性就相應增強；而去殼曬干的花生結構較帶殼曬干的花生更緊湊，這可能導致其IgE結合能力弱于帶殼曬干的花生。

3 結 論

曬干處理后，花生總蛋白含量減少，其中去殼曬干花生蛋白減少了0.74 g/100 g，帶殼曬干花生減少了3.25 g/100 g。花生中可提取蛋白的總量基本不變，但提取獲得的過敏原蛋白含量明顯增加，特別是Ara h 3/4，在去殼曬干花生中的含量增長了69.97%，帶殼曬干花生中增長了62.60%，這會導致花生潛在致敏性的增強。帶殼曬干和去殼曬干2 種方式對花生蛋白結構的影響也不同，去殼曬干花生中提取到的蛋白中，α-螺旋結構的含量增長了109.8%，二級結構更為有序，三級結構更為緊湊，這導致其潛在致敏性弱于帶殼曬干的花生。

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