橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實品質的影響

鞠延侖，宇 航，劉 敏，趙現方，樂小鳳，房玉林,2,*

釀酒葡萄果實品質直接決定葡萄酒的品質，而葡萄果實品質又取決于果實糖、有機酸、花色苷和酚類物質的組成及含量[1]。目前有關釀酒葡萄的研究主要集中在栽培措施[2]、外源激素[3]、環境因素[4]等對其果實理化性質的影響方面。葡萄香氣類物質是決定果實品質的另一重要因素，葡萄品種香氣物質包括揮發性分子和無味的前體物質2 種形式，后者是形成葡萄酒香氣的潛在物質，在葡萄酒釀造過程和熟化過程中，它們可以轉化為氣味活性化合物[5-6]。

葡萄果實香氣類物質的種類和含量取決于葡萄品種和“風土”效應，與土壤、氣候、栽培技術和生長環境有關。上述因素直接影響葡萄果實品質，進而影響葡萄酒的香氣品質[7]。比如在桉樹林附近葡萄園的葡萄因為吸收了桉樹的氣味所釀出的葡萄酒具有植物性香氣，雖然外部因素對香氣的影響機制尚不明確，但是桉樹中含有桉油精，散發具有桉樹的氣味，是一種萜烯類化合物，葡萄吸收后可以轉化為其他萜類化合物，從而形成組成葡萄酒特定香氣的成分[8]。研究表明某些適用于葡萄園的殺真菌劑可以影響葡萄酒的香氣，尤其是品種香氣[9]。

近幾年，已有研究證明葡萄可以吸收煙霧中的氣味物質，從而在葡萄和葡萄酒中有煙味的感官特點[10-13]。煙霧在葡萄和葡萄酒生產上的應用，表明了煙霧中的揮發性化合物如愈創木酚、4-甲基愈創木酚、糠醛、苯酚、丁香酚先被植物所吸收，然后轉化到葡萄汁和葡萄酒中[10]，特別是在葡萄轉色期之后的7 d，煙的吸收效果很明顯[12]，但是否影響果實糖、有機酸和酚類等組分鮮見報道。葡萄在充滿煙霧的環境下暴露1 h和葡萄酒在橡木桶中浸泡1 h會出現同樣的感官特征，這是因為在橡木桶中的某些化合物和煙霧中的相同[13]。

事實上，橡木桶需要使用很長一段時間來熟化葡萄酒，特別是紅葡萄酒，因為它改善了葡萄酒的特性，特別是酚類物質和香氣。從這個意義上說，葡萄酒與橡木接觸萃取揮發性化合物，呈現出的如“木頭味”、“椰子味”、“香料味”、“烘烤味”和“煙熏味”的香氣濃度，與橡木中的化合物如橡木內酯、丁香酚、香蘭素和愈創木酚等的含量成正比[14-15]，這些化合物存在于天然的橡木中，或者是在橡木桶的烘烤過程當中形成[16]。同時，葡萄酒中單寧和花色苷等酚類物質在橡木桶中陳釀時也發生變化[1,17]。葡萄產業鏈中會產生大量廢棄物，如皮渣、枝條、橡木片等，目前關于皮渣和枝條化學組分及初步應用已有報道[18-19]，但對橡木片的研究應用鮮有報道，尤其在橡木片或橡木片提取液對果實糖、有機酸、花色苷和酚類物質影響方面需進一步研究。

綜上所述，葡萄可能會吸收橡木浸出物中的化合物。目前，關于外源橡木提取液對葡萄果實理化指標、酚類物質和香氣影響的研究鮮有報道，本研究旨在探索橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實糖、有機酸、酚類和香氣物質的影響，為橡木廢棄物的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以6年生釀酒葡萄（Vitis Vinifera L.）霞多麗（Chardonnay）和赤霞珠（Cabernet Sauvignon）為原料。葡萄架式為“廠”字形，株行距為1.5 m×3.8 m，常規管理。

橡木片由寧夏諾盟生物有限公司提供，選用烘烤度中度的法國橡木和美國橡木。

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、鹽酸、乙酸乙酯（均為分析純） 天津科密歐試劑公司；葡萄糖、果糖、蘋果酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸、2-辛醇 美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）美國ACS試劑公司。

1.2 儀器與設備

UV-1700紫外-可見分光光度計、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司；超聲波振蕩器 昆山禾創超聲儀器有限公司；Centrifuge 5424R離心機 德國Eppendorf公司；冷凍干燥機 山東博科生物產業有限公司；TRACE DSQ氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國Thermo Fisher公司；pH計 梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；FA2004型電子天平 上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橡木提取液制備

橡木片加到去離子水中（1∶1，m/m），100 ℃煮沸30 min，浸泡32 h，得到純橡木提取液，用紗布過濾去除雜質，再用去離子水稀釋，得到體積分數為25%的橡木提取液[20]。

1.3.2 葡萄處理

在果實轉色初期，于晴朗無風的傍晚，將橡木提取液均勻噴在果實表面，每個處理15 棵樹，重復3 次，以噴蒸餾水為對照組。果實成熟時，每個處理采300～500 粒，用蒸餾水洗凈并用吸水紙吸干水分，于-20 ℃保存待用。

1.3.3 基本理化指標的測定

總糖的質量濃度測定采用斐林試劑滴定法[21]。總酸的質量濃度采用酸堿滴定法[22]。pH值的測定采用pH計法[23]。百粒質量即為100 粒果實的質量。

1.3.4 酚類物質含量的測定

果皮酚類物質提取參考房玉林等[23]的方法。取葡萄150 粒，去除果肉和種子，將果皮用超純水沖洗干凈，并用吸水紙吸干多余水分，放置于-20 ℃冰箱內備用。提取時，準確稱取1.0 g果皮轉移至50 mL離心管中，加入20 mL鹽酸甲醇溶液（體積分數60%甲醇、體積分數0.1%鹽酸，體積比1∶20），避光條件下于超聲波振蕩器中30 ℃、40 kHz提取30 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，于60 mL棕色瓶中保存。將離心管中剩余沉淀物按上述步驟重復提取2 次，合并上清液于60 mL棕色瓶中搖勻，于-20 ℃冰箱中保存。

葡萄果皮中總酚含量的測定采用福林-肖卡法[24]；單寧含量的測定采用甲基纖維素沉淀法[25]；花色苷含量的測定采用pH值示差法[26]。

1.3.5 葡萄糖、果糖含量的測定

標準溶液配制：準確稱取葡萄糖和果糖各1.000 g于10 mL容量瓶中，用純水溶解并定容，得到100 g/L可溶性糖混合標準溶液，依次用純水稀釋配成50、40、20、10 g/L的可溶性糖混合標準溶液，用0.45 μm濾膜過濾，然后放到樣品瓶中，置于20 ℃冰箱備用。

樣品制備：隨機選取葡萄果實樣品，將葡萄果實樣品在液氮保護下剝去果皮、去籽，準確稱取3.000 g樣品于15 mL離心管中，加入體積分數80%的乙醇溶液6.0 mL，35 ℃超聲波振蕩提取20 min，之后在8 000 r/min、20 ℃條件下離心10 min，取上層清液，重復提取3 次，合并上清液于35 ℃減壓濃縮，最后定容至10 mL，用0.45 μm濾膜過濾后采用HPLC進行測定。

色譜條件：Z O R B A X S B-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（75∶25，V/V）；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；示差檢測器；分析時間20 min。根據標準樣品進行定量計算。

1.3.6 有機酸含量的測定

標準溶液配制：分別準確稱取草酸、酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸0.200 g于10 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻備用，準確吸取上述6 種有機酸溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用流動相定容，得到2.0 g/L有機酸混合標準溶液，依次用流動相稀釋配成1.000、0.500、0.250、0.125 g/L的有機酸混合標準溶液，用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，置于20 ℃備用。

樣品制備：隨機選取葡萄果實樣品，將葡萄果實樣品在液氮保護下剝去果皮、去籽，準確稱取1.000 g樣品于25 mL離心管中，加入8 mmol/L的磷酸提取液10 mL，25 ℃超聲波振蕩提取10 min，之后在4℃、8 000 r/min條件下離心20 min，取上層清液，用0.45 μm濾膜過濾后進行測定。

色譜條件：Hypersil GOLD aQ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.01 mol/L KH2PO4溶液（pH 2.2）；流速0.5 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長210 nm；分析時間30 min。根據標準樣品進行定量計算。

1.3.7 香氣成分質量濃度的測定

參考姜文廣[27]、于立志[28]等的方法，用頂空固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）法提取橡木提取液和葡萄果實香氣物質，采用GC-MS法測定香氣成分質量濃度。取100 g葡萄果粒，去籽后加入液氮研磨成粉末，裝于離心管中，于4 ℃條件下靜置2.5 h，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，吸取20 mL上清液于樣品瓶中，加入2 g NaCl、20 μL 2-辛醇（0.234 g/L）和磁力轉子（2 cm×0.5 mm），蓋上瓶蓋，置于SPME操作臺，設置轉速為900 r/min，室溫下保持2 h。萃取完成后以超純水沖洗攪拌棒，無塵紙巾擦干后置于熱脫附管中，進行下一步實驗。

熱脫附儀的分析條件：He為載氣；脫附流速45 mL/min；加熱閥溫度245 ℃；脫附管溫度270 ℃；脫附15 min；傳輸線溫度255 ℃；冷阱捕集溫度-30 ℃；以40 ℃/min升至255 ℃（二級解吸冷阱溫度）；出口分流比為3∶1；進樣He流速1 mL/min。

GC條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He為載氣；流速1 mL/min；柱溫40℃保持3 min，隨后以4 ℃/min升至160 ℃，7 ℃/min至230 ℃，保持8 min；連接桿溫度設為230 ℃。

MS條件：全掃描，范圍為33～450 amu，每秒掃描1 次。電子轟擊離子源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；燈絲電流0.2 mA；檢測器電壓350 V。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 橡木提取液對葡萄理化指標的影響

表1 橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄理化指標的影響Table 1 Effect of oak extracts on physicochemical characteristics of grape berries

如表1所示，不同橡木提取液處理之后，霞多麗葡萄果實百粒質量略有提高，但對果實總糖、總酸的質量濃度和pH值基本無影響。對赤霞珠葡萄果實的百粒質量、總糖質量濃度、總酸質量濃度及pH值基本無影響。說明橡木提取液對果實發育可能沒有影響。

2.2 橡木提取液對果實酚類物質的影響

表2 橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實總酚、單寧和花色苷含量的影響Table 2 Effect of oak extracts on the content of total phenols, tannins and anthocyanins of grape berries

由表2可知，赤霞珠葡萄果實酚類物質含量明顯高于霞多麗。對霞多麗而言，純美國橡木提取液處理后，霞多麗總酚含量達49.675 mg/g；體積分數25%美國橡木提取液處理后，霞多麗單寧含量達28.814 mg/g，比對照組增加了33.2%；霞多麗果實中總花色苷含量很少，除純法國橡木提取液顯著提高霞多麗花色苷含量外，其他處理對霞多麗花色苷含量無顯著影響。對赤霞珠而言，與對照組相比，除體積分數25%美國橡木提取液對總酚含量無顯著影響外，其他純度提取液降低了總酚含量；除體積分數25%法國橡木提取液對單寧無顯著影響外，其他處理均顯著提高了單寧含量，且體積分數25%美國橡提取液處理后的赤霞珠單寧含量達到59.621 mg/g，比對照組增加了40.7%；美國橡木提取液也可提高赤霞珠果實花色苷含量，且純美國橡木提取液處理后的花色苷含量達5.047 mg/g，顯著高于對照組，比對照組增加了10.7%。總之，對于霞多麗葡萄，橡木提取液的使用增加了果實總酚、單寧含量，對花色苷含量基本無顯著影響；而對于赤霞珠葡萄，橡木提取液處理降低了果實總酚含量，提高了單寧和花色苷含量。

2.3 橡木提取液對果實果糖、葡萄糖含量和有機酸含量的影響

表3 橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實葡萄糖和果糖含量的影響Table 3 Effect of oak extracts on the contents of fructose and glucose in grape berries

由表3可知，對于霞多麗和赤霞珠，法國橡木提取液處理組葡萄的果糖含量均高于同一純度美國橡木提取液組。對于果糖來說，在霞多麗葡萄品種中，法國橡木低純度時，果糖含量略有增加，高純度時，果糖含量顯著增加，達41.275 mg/g；與對照組相比，體積分數25%美國橡木提取液處理組的果糖含量顯著降低，而純美國橡木提取液處理組的果糖含量顯著增加（P＜0.05）；在赤霞珠品種中，與對照組相比，體積分數25%法國橡木提取液處理組的果糖含量略有增加，而純法國提取液處理組的果糖含量顯著增加（P＜0.05），體積分數25%美國橡木提取液處理時，果糖含量稍有降低，但無顯著性差異，純美國橡木提取液處理時，果糖含量顯著增加。對于葡萄糖來說，在霞多麗葡萄品種中，體積分數25%法國橡木提取液處理時，葡萄糖含量明顯增加，純法國橡木提取液處理時增量更多，含量達48.533 mg/g；體積分數25%美國橡木提取液處理時，葡萄糖含量顯著增加；在赤霞珠品種中，體積分數25%法國橡木提取液處理組葡萄糖含量顯著增加，純法國橡木提取液處理組的增量更多，含量達47.498 mg/g，體積分數25%美國橡木處理組葡萄糖含量略有增加，純美國橡木提取液處理組增加顯著。總之，純橡木提取液可以提高霞多麗和赤霞珠果實果糖含量；同時，橡木提取液的使用可以提高霞多麗和赤霞珠果實葡萄糖含量。

表4 橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實有機酸含量的影響Table 4 Effect of oak extracts on the content of organic acids in grape berries

葡萄果實中的有機酸含量及種類是決定葡萄和葡萄酒品質的重要因素之一[17]。由表4可知，葡萄果實中含量最高的是酒石酸，其次是蘋果酸和乳酸。赤霞珠果實中的有機酸單體含量高于霞多麗葡萄。外源噴施橡木提取液可以改變葡萄各有機酸單體的含量，且與提取液濃度、橡木品種及葡萄品種有關。外源橡木提取液主要影響霞多麗葡萄果實酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量，純橡木提取液可顯著提高果實乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量。對赤霞珠而言，橡木提取液主要影響果實酒石酸、蘋果酸、琥珀酸含量。橡木提取液處理使果實酒石酸含量略有降低，純美國橡木提取液可增加果實蘋果酸和乳酸含量，分別達3.184、1.942 mg/g，顯著高于對照組。橡木提取液可以不同程度地降低霞多麗和赤霞珠果實酒石酸含量，有助于減少葡萄酒尖酸的口感，改善品質。

2.4 橡木提取液對果實香氣成分的影響

葡萄果實的香氣類物質含量直接決定著果實品質。釀酒葡萄的香氣成分及含量決定著葡萄酒品質[17]。如表5所示，在霞多麗葡萄果實中檢測出21種主要香氣類物質，其中包括醇、酚、酯、醛、酮等。外源橡木提取液可以顯著增加霞多麗果實香氣類物質質量濃度，尤其是酯類、醛類和醇類物質，其中2-己烯-1-醇乙酸酯、呋喃甲醛、四氫薰衣草醇增加最為顯著。其中四氫薰衣草醇為霞多麗果實本來沒有的香氣物質，噴施橡木提取液后在果實中檢測到該香氣成分，增加了果實香草類香氣。在赤霞珠葡萄果實中檢測出25 種主要香氣類物質，外源橡木提取液可以顯著提高果實部分香氣類物質質量濃度，與對照組相比香草酸甲酯質量濃度增加將近2 倍，最高達1.962 μg/L；丁子香酚質量濃度最高達31.564 μg/L，增加了約7倍；香草乙酮質量濃度最高增加了5 倍，達1.260 μg/L，對照組為0.256 μg/L。同時，在處理后的赤霞珠果實中檢測到原本不存在的橡木內酯類香氣成分，如體積分數25%美國橡木提取液可使6-甲氧基丁子香酚的質量濃度增加近8倍，這可能是果實吸收了橡木提取液的香氣成分（表6）。橡木提取液對霞多麗和赤霞珠果實香氣成分有很大影響，都增加了果實香氣成分質量濃度和種類，尤其是酯類、醛類和醇類，這些成分可能賦予果實更多的果香，有利于釀造高品質葡萄酒。

表5 橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實香氣成分質量濃度的影響Table 5 Effect of oak extracts on the contents of volatile aromas in grape berries

表6 橡木提取液揮發性香氣物質質量濃度Table 6 Concentrations of volatile aromas in different oak extractions

3 討 論

3.1 橡木提取液對葡萄果實基本理化指標的影響

結果表明，外源噴施橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實百粒質量、總糖質量濃度、總酸質量濃度和pH值無顯著影響，這可能說明橡木提取液不參與果實生長發育。外源噴施橡木提取液可影響果實可溶性糖和有機酸單體含量，具體地，所選不同純度橡木提取液均可提高果實葡萄糖含量，而僅純橡木提取液可提高果實果糖含量；純橡木提取液可以提高赤霞珠果實蘋果酸、乳酸含量，目前鮮見報道外源橡木提取液對葡萄果實糖和有機酸單體的影響，具體機理尚不明確，有待進一步研究。

3.2 橡木提取液對葡萄果實酚類物質的影響

橡木提取液對霞多麗和赤霞珠果實品質指標的影響與橡木片的品種、提取液純度和葡萄品種緊密相關。橡木提取液的使用可以增加霞多麗果實總酚、單寧含量和增加赤霞珠果實花色苷含量。Pardo-García[13]和Martínez-Gil[20]等研究發現葡萄可以吸收周圍環境中的物質，在充滿煙霧的環境下暴露1 h的葡萄與橡木桶中浸泡1 h的葡萄酒會出現相同的感官特征，這是因為在橡木桶中的某些化合物和煙霧中的相同，橡木提取液中的某些化合物（如單寧）可能會被葡萄果實吸收進而影響其單寧含量，同時也可能會增加花色苷的穩定性。

3.3 橡木提取液對葡萄果實香氣物質的影響

內酯類化合物是橡木的特征香氣物質，在橡木烘烤過程中形成[29]。這類物質在葡萄酒中呈現烤焙、椰子、橡木類香氣特性。本研究發現橡木提取液中共檢測出14 種香氣類物質，與Martínez-Gil等[20]的研究結果一致。外源橡木提取液可以顯著增加果實香氣成分種類和質量濃度，尤其是醇類和酯類物質；在橡木提取液處理后的霞多麗果實和赤霞珠果實中分別檢測到其本身不含有的四氫薰衣草醇和2 種橡木內酯，這可能是由于果實吸收了橡木提取液中的香氣組分；前人研究表明，外源橡木提取液或煙熏確實能夠改變果實的香氣類物質成分[20,30]，本研究也證實了這一結論。結果證明，外源橡木提取液可以改善果實品質，尤其是香氣，這可能是由于葡萄吸收橡木液提取成分后可以轉化為其他萜類化合物從而形成組成葡萄酒特定香氣的成分。

4 結 論

外源噴施橡木提取液對霞多麗和赤霞珠葡萄果實品質產生影響。外源橡木提取液處理對兩種葡萄果實基本指標影響不顯著，但增加了霞多麗果實總酚、單寧含量，也可以增加赤霞珠單寧和花色苷含量，同時可以提高果實香氣成分的質量濃度，尤其是醇類、醛類和酯類香氣物質，進而增加果實感官特性。外源噴施橡木提取液可能會改善釀酒葡萄果實品質，最終可能會改善葡萄酒的品質特征，但具體機理還需進一步研究。

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