山楂果膠寡糖的抑菌性能及機理

王 巍，牟德華*，李丹丹

當今社會因食源性病菌引起的食物污染嚴重影響著人們的健康[1]。大量食品的腐敗變質是對社會資源的浪費，對社會經濟的可持續發展造成不利影響。抑制食源性腐敗菌的滋生對延長食品貨架期尤為重要[2]。

果膠分子是由半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵連接而成的多糖鏈，一般由半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖等組成側鏈[3]。研究表明，果膠本身沒有抑菌活性，但分解所得的低分子質量寡糖被認為具有一定的抑菌功能[4]，可作為安全的天然防腐劑并顯示出極大的開發應用前景[5-6]。Bouaziz等[7]研究了杏仁膠寡糖對病原菌和真菌的抑菌效果及其對牛肉的保鮮效果，結果顯示杏仁膠寡糖有著較好的抑菌效果，延長了肉制品貨架期。李拖平等[8]就離體條件下山楂果膠寡糖對食品腐敗微生物枯草芽孢桿菌的抗菌作用進行了研究和考察，結果表明山楂果膠寡糖與其他天然食品添加劑復配要比單獨使用有更強的抑菌作用。Di Rong等[9]研究了柑橘果膠寡糖對雙歧桿菌和乳酸菌的益生作用，發現其提高了對產志賀毒素大腸桿菌的抗黏附活性，結果表明低聚糖有潛力運用于治療細菌性疾病藥物和功能性食品。Liu Xiaoli 等[10]研究了曲酸枝殼寡糖對革蘭氏菌的抑菌效果，并測定了菌體的膜通透性，通過細菌生長規律可以看出抑菌效果顯著，可作為一種新型抗菌劑作用于革蘭氏菌。

本研究通過對山楂果膠進行酶解，分離制得不同聚合度寡糖，考察自制寡糖的抑菌性能及抑菌機理，為其在天然食品防腐劑開發中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由河北科技大學微生物實驗室提供。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌使用牛肉膏蛋白胨培養基；植物乳桿菌用乳酸細菌培養基；釀酒酵母菌用酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（lysogeny broth，LB），相對應液體培養基不加瓊脂。

半乳糖醛酸（標準品）、葡聚糖凝膠G 5 0美國Sigma公司；復配酶制劑、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠酯酶（pectinesterase，PP）上海康禧食品飲業有限公司；對硝基苯磷酸二鈉四水鹽、Tris-HCl、鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷 上海寶曼科技有限公司；咔唑 上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

EPOCH2全波長酶標儀 美國博騰儀器有限公司；S-4800-I場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；7HZ-82A水浴恒溫振蕩器 常州榮華儀器制造有限公司；KQ5200DE數控超聲清洗器 昆山市起聲儀器有限公司；D-1-70型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋 北京發恩科貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌實驗

1.3.1.1 山楂果膠寡糖的制備

本實驗前期制得山楂果膠，酶解果膠生成寡糖并通過葡聚糖凝膠柱進行分離收集，得到了平均聚合度2～5的果膠寡糖，于4 ℃冷藏待用。

總糖質量濃度測定用咔唑比色法，得到D-半乳糖醛酸質量濃度ρ1（mg/L）與吸光度A1的回歸方程ρ1＝0.008 3A1-0.033 5（R2＝0.999 0），其中ρ1范圍為0～140 mg/L。

還原糖質量濃度測定用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法，得到D-半乳糖醛酸質量濃度ρ2（mg/L）與吸光度A2的回歸方程ρ2＝0.226 3A2-0.019 9（R2＝0.999 8），其中ρ2范圍為0 ～2 mg/mL。

按照式（1）計算果膠寡糖平均聚合度[11]。

式中：ρ1、ρ2分別為酶解液中總糖和還原糖的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.1.2 不同聚合度寡糖對抗菌性的影響

參考李大峰等[12]的方法并略作修改。采用打孔法測定抑菌圈大小，將100 mL菌液（濃度確定為107CFU/mL）分別加入到凝固好固體培養基的培養皿中，均勻涂布，靜置5 min。用打孔器在培養基上打出直徑為6 mm的圓孔，然后于每孔中滴加少量固體培養基封底[13]，往圓孔中注入10 μL果膠寡糖溶液，靜置5 min，放置于培養箱中在37 ℃下恒溫培養24 h，抑菌圈直徑用游標卡尺測量，對照組為不經過酶解的果膠液。

1.3.1.3 測定最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

根據劉奕等[14]的方法并略作修改。本實驗采用雙倍稀釋法，用與培養受試菌種相應的液體培養基稀釋成平均聚合度為3的2 倍質量濃度梯度的寡糖溶液，分別加入含有20 mL培養基的錐形瓶中，使得果膠寡糖溶液質量濃度最終為0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000 g/L，分別標為1～8號，再向每個錐形瓶中分別加入50 μL菌液（107CFU/mL）。將1～8號錐形瓶固定于搖床上，以200 r/min在37 ℃恒溫搖床培養12 h，肉眼不可見渾濁的最小質量濃度為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。取清澈的不同質量濃度的菌液涂板培養，無菌生長的最小質量濃度為最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）[15]。

1.3.1.4 生長曲線的測定

參考Liu Guorong等[16]的方法并略作修改。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母菌5 種供試菌種，100 μL菌液（107CFU/mL）分別加入到相對應盛放有50 mL液體培養基的150 mL錐形瓶中，每種菌接種4 個錐形瓶。將平均聚合度為3的果膠寡糖溶液分別加入到錐形瓶中，控制最終質量濃度分別為0.2、0.5、1×MIC，不加寡糖溶液為對照。盛有釀酒酵母菌液錐形瓶置于28 ℃、其余錐形瓶置于37 ℃，200 r/min搖床培養，每隔1 h在無菌條件下取樣在660 nm波長處測定吸光度以反映微生物生長狀態，繪制供試菌的生長曲線。

1.3.2 抑菌機理的研究

1.3.2.1 菌體形態的測定

參考馮亞凈等[17]的方法并略作修改。采用SEM觀察菌體形態。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌于液體培養基中37 ℃恒溫培養12 h（107CFU/mL）。0、1×MIC的果膠寡糖溶液分別加入到5 mL菌懸液中，37 ℃、200 r/min搖床中培養4 h。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液將培養后的菌液清洗3 次，加入適量的戊二醛溶液后于4 ℃環境下放置4 h。使用體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇和無水乙醇進行脫水，靜置10 min，然后用叔丁醇置換出乙醇。干燥，離子濺噴金，SEM觀察。

1.3.2.2 相對電導率的測定

本實驗選取抑菌實驗效果最為明顯的3 種菌即大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為供試菌種。參考Diao Wenrui等[18]的方法，3 種菌分別接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，37 ℃恒溫培養12 h，4 000 r/min離心15 min，收集菌體，用質量分數5%的葡萄糖溶液洗至菌液相對電導率與其相等，作為等滲菌懸液（107CFU/mL）。將不同質量濃度的果膠寡糖溶液（0、1×MIC和1×MBC）分別加入到5%葡萄糖溶液中并混勻，測其相對電導率，記為L1。將不同質量濃度的果膠寡糖溶液（0、1×MIC和1×MBC）分別加入到等滲菌液中，放于37 ℃搖床中培養6 h，每隔1 h取出測定相對電導率，記為L2。將等滲菌懸液用電磁爐煮5 min，等待溫度緩慢下降后，測相對電導率，記為L0。菌種膜通透性的相對電導率根據公式（2）[19]計算。

1.3.3 細胞膜完整性的測定

1.3.3.1 蛋白質核酸含量的測定

參考Lü Fei等[20]的方法并略作修改。取供試菌液30 mL，4 500 r/min離心15 min，菌體用pH 7.4磷酸鹽緩沖液清洗3 次，并用磷酸鹽緩沖液定容到100 mL。將不同質量濃度的果膠寡糖溶液（0、1×MIC和1×MBC）各加入到20 mL菌懸液中，37 ℃搖床培養3 h。隨后，菌懸液8 000 r/min離心5 min，取上清液在260 nm波長處測定其吸光度，菌懸液中核酸的相對含量用A260nm表示。另取上清液，用考馬斯亮藍法測595 nm波長處的吸光度，表示蛋白質相對含量。

1.3.3.2 堿性磷酸酶活力的測定

參考金山[11]的方法并略作修改。取活化后的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌各50 mL菌液4 000 r/min離心15 min，得到菌體，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后重新懸浮。將平均聚合度為3的果膠寡糖溶液加入到菌懸液中，使菌懸液終濃度為1×MIC，對照組為不加果膠寡糖組，37 ℃恒溫培養，每小時定時取樣，將1 mL樣品用0.4 μm濾菌膜過濾，隨后將0.2 mL濾液加入1.8 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含0.2 mg/mL對-硝基苯磷酸二鈉四水鹽）中混勻，混合液于23 ℃水浴30 min。用OD410nm表示溶液堿性磷酸酶活力[21]。

1.3.3.3 β-半乳糖苷酶活力的測定

前處理同1.3.3.2節，取2 mL樣品8 000 r/min離心10 min，收集菌體懸浮于3 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）中，加入0.5 mL 4 mg/mL的鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷、0.1 mL 0.2 mol/L的Na3PO4（pH 7.0），25 ℃水浴30 min。加入1.5 mL的1 mol/L的Na2CO3終止反應。以OD410nm表示β-半乳糖苷酶活力。

1.4 數據統計分析

用SPSS 17.0軟件進行統計分析，組間數據比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義，所得數據以表示。

2 結果與分析

2.1 不同平均聚合度果膠寡糖對抑菌性的影響

圖1 不同平均聚合度果膠寡糖對抑菌性的影響Fig. 1 Effect of pectin oligosaccharides with different averagepolymerization degrees on bacteriostasis

收集葡聚糖凝膠柱不同出峰管數所對應寡糖溶液并測定其平均聚合度，得到果膠寡糖平均聚合度為2～5。質量濃度為1 g/L的各個聚合度山楂果膠寡糖對釀酒酵母菌和植物乳桿菌抑菌圈均不明顯，選取抑菌圈效果明顯的3 株菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌），結果如圖1所示。不同平均聚合度寡糖對3 種致病菌展現出不同的抑菌性能，其中平均聚合度為3的寡糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑最大，分別為16.5、15.0、20.5 mm，未經酶解的果膠液沒有抑菌效果。從抑菌圈和MIC、MBC結果來看大腸桿菌對果膠寡糖的耐受性要優于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，說明不同的菌株對果膠低聚糖的耐受力不一樣。這可能是由于革蘭氏陰性菌所存在的高脂多糖含量雙層膜結構比革蘭氏陽性菌的單層膜結構更能抵制果膠寡糖的侵入[22]。綜上所述，以下抑菌實驗均采用平均聚合度為3的果膠寡糖。

2.2 果膠寡糖的抑菌性能

2.2.1 MIC和MBC測定結果

表1 平均聚合度為3的果膠寡糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑、MIC和MBCTable 1 Inhibitory zone diameters, MICs and MBCs of pectin oligosaccharides with average polymerization degree of 3 against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus subtilis

表2 培養皿中菌落生長情況Table 2 Colony growth in Petri dishes with different concentrations of pectin oligosaccharides with average polymerization degree of 3

由表1可以看出，枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑最大，為20.50 mm，且果膠寡糖的MIC和MBC最低，分別為0.625 g/L和1.250 g/L。由此表明平均聚合度為3的果膠寡糖對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，其次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。但對釀酒酵母菌和植物乳桿菌的抑菌效果不明顯，在受藥質量濃度范圍內沒有MIC，由表2也可以看出，果膠寡糖對釀酒酵母和植物乳桿菌的抑制效果不明顯，在受藥質量濃度范圍也不存在MBC。

2.2.2 果膠寡糖對5 種供試菌生長曲線的影響

圖2 果膠寡糖對5 種供試菌生長曲線的影響Fig. 2 Effect of pectin oligosaccharides on growth curves of ベve test bacteria

從圖2可以看出，在對照組中5 種供試菌種均正常生長，有明顯的指數期、平穩期等特征。在加入0.2 g/L和0.4 g/L果膠寡糖后，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌生長速率明顯減緩，對數期、平穩期延后；在加入1 g/L果膠寡糖后，這3 種菌懸液的A660nm隨著時間的推移基本沒有變化，菌體停止生長；可以看出果膠寡糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果明顯。隨著加入果膠寡糖質量濃度的增加，釀酒酵母菌和乳酸菌生長也受到了一定程度的抑制，但效果不明顯。

2.3 抑菌機理

2.3.1 果膠寡糖對菌體形態的影響

由SEM結果可知，未添加果膠寡糖的對照組中菌體細胞完整（圖3B、D），細胞壁和細胞膜較為完整光滑，菌體外觀形態正常。當加入1×MIC的果膠寡糖時（圖3A、C），金黃色葡萄球菌菌體大量塌陷，胞膜表面不平整，失去了圓滑的球狀形態，形態遭到嚴重破壞。大腸桿菌菌體變形，甚至被降解，胞壁胞膜受損嚴重，細胞質外漏。這種變化可能是由于果膠寡糖引起了胞膜組分的溶解和轉變[23]，破壞了細胞膜的完整，使菌體細胞變形凹陷，從而抑制菌體的生長。

圖3 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌SEM圖Fig. 3 SEM of Staphylococcus aureus and Escherichia coli

2.3.2 果膠寡糖對膜通透性的影響

圖4 果膠寡糖溶液對3 種菌相對電導率的影響Fig. 4 Effect of pectin oligosaccharide on relative conductivity of three strains

由圖4可以看出，1×MIC和1×MBC組隨著果膠寡糖加入，菌液中相對電導率迅速增大，之后增長趨于平緩。說明菌體胞膜被破壞，內容物溢出，影響膜通透性；并且，相對電導率數值與寡糖質量濃度成正比關系，說明實驗中高質量濃度的果膠寡糖對胞膜的破壞性更強。在6 h枯草芽孢桿菌相對電導率最高，即果膠寡糖對枯草芽孢桿菌胞膜破壞性最強。菌體細胞膜相當于一道屏障，K＋、Na＋、H＋等可以通過，這些離子能保證胞膜正常發揮作用。這種對小分子物質的滲透作用受控于膜結構[24]。果膠寡糖首先進入細菌的細胞壁，將壁破壞后開始攻擊細胞膜，細胞膜受到影響后離子穩態失衡，影響菌體的代謝，最終導致菌體死亡[25]。對照組隨時間延長相對電導率略有升高，可能由菌體自溶引起。

2.3.3 果膠寡糖對細胞膜完整性的影響

表3 不同質量濃度果膠寡糖對菌體細胞膜的影響Table 3 Effect of different concentrations of pectin oligosaccharides on the cell membrane

果膠寡糖對菌體膜完整性的影響由菌體核酸、蛋白質釋放量表示，測定結果如表3所示。加入1×MIC果膠寡糖后，3 種菌核酸釋放量均增大，當加入果膠寡糖質量濃度增加到1×MBC后，核酸增長幅度加大。蛋白質的釋放趨勢同核酸，果膠寡糖的加入使懸液中蛋白質含量成倍增長。此內溶物釋放趨勢與Shen Suxia等[26]的結果相同。

核酸、蛋白質等大分子物質貫穿于整個胞膜和胞質當中，是組成細胞的重要結構物質[28]，核酸、蛋白質等大分子物質的外溢表明胞膜完整性遭到了破壞。可能因為果膠寡糖直接作用胞壁和胞膜結構，破壞了膜完整性，致使核酸、蛋白質大量泄漏，影響其代謝活動進行，最終導致細菌死亡。或者破壞胞壁致使細胞失去胞壁的保護，最終使細菌溶解死亡[28]。

2.3.4 細胞壁和細胞膜完整度

圖5 果膠寡糖對菌體細胞堿性磷酸酶（A）和β-半乳糖苷酶（B）活力的影響Fig. 5 Effect of pectin oligosaccharides on intracellular alkaline phosphatase (A) and beta galactosidase (B) activity

一般而言，堿性磷酸酶存在于細胞膜與細胞壁之間，而β-半乳糖苷酶存在于細胞膜內，菌液中不會存在這兩種酶[29]。因此，如果在菌液中檢測到堿性磷酸酶，則證明它是從裂口中漏出來的，說明細胞壁已經被破壞。同理如果在菌液中檢測到β-半乳糖苷酶即可證實細胞膜被破壞。通過檢測菌液中兩種酶活性的強弱可以表示細胞壁和細胞膜的透性變化和被破壞的程度[30]。

從圖5A可以看出，實驗組與對照組相比溶液中堿性磷酸酶活力開始增大，說明果膠寡糖對3 種菌的細胞壁產生破壞，使堿性磷酸酶從缺口中漏出。從圖5B中可看出，在作用2 h后，溶液中β-半乳糖苷酶含量增加，該結果說明果膠寡糖首先破壞了菌體的細胞壁，正所謂“唇亡齒寒”，細胞壁被損壞，細胞沒有了保護自己的軀殼，細胞膜結構必將由于細胞質的膨脹壓而損壞，菌體脹裂死亡。枯草芽孢桿菌的對照組和實驗組OD值差距大于其余兩種菌，這也和前面抑菌圈實驗結果相吻合。

3 結 論

現階段，越來越多的人青睞于綠色、健康的天然食品。山楂果膠寡糖作為提取于山楂中的天然物質，具有良好的抑菌效果，迎合了綠色食品趨勢。本實驗研究了山楂果膠寡糖作用于5 種供試菌的抑菌性，得出結果：平均聚合度為3的山楂果膠寡糖抑菌效果最好；其中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑菌效果，其MIC分別為0.625、1.250 g/L和0.625 g/L，抑菌圈直徑分別為16.5、15.0 mm和20.5 mm。另外，本研究從多方面闡述了果膠寡糖的抑菌機理：SEM圖顯示出果膠寡糖破壞了菌體的形態，細胞表面褶皺、凹陷、菌體死亡；可能因為果膠寡糖影響了菌體胞膜的通透性，離子穩態破壞導致相對電導率失衡；胞壁受損致使細菌不能耐受菌體內的高滲透壓而脹裂死亡，核酸、蛋白質大量泄漏，大量堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶泄漏到菌液中。本實驗將為山楂果膠寡糖作為天然、經濟的抑菌劑更好地應用于食品保鮮提供了理論依據。

[1] VONGKAMJAN K, WIEDMANN M. Starting from the bench:prevention and control of foodborne and zoonotic diseases[J].Preventive Veterinary Medicine, 2015, 118(2/3): 189-195.DOI:10.1016/j.foodchem.2015.06.076.

[2] BIAN X, MUHAMMAD Z, EVIVIE S E, et al. Screening of antifungal potentials of Lactobacillus helveticus KLDS 1.8701 against spoilage microorganism and their effects on physicochemical properties and shelf life of fermented soybean milk during preservation[J]. Food Control, 2016, 66: 183-189. DOI:10.1016/j.foodcont.2016.02.004.

[3] JAYANI R S, SAXENA S, GUPTA R. Microbial pectinolytic enzymes: a review[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(9): 2931-2944.DOI:10.1016/j.procbio.2005.03.026.

[4] 李學紅, 馬慶一, 張昱, 等. 果膠酶解液抑菌性能的研究[J]. 食品工業科技, 2003, 24(1): 51-53. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2003.01.019.

[5] MUZZARELLI R A A, BOUDRANT J, MEYER D, et al. Current views on fungal chitin/chitosan, human chitinases, food preservation,glucans, pectins and inulin: a tribute to Henri Braconnot, precursor of the carbohydrate polymers science, on the chitin bicentennial[J].Carbohydrate Polymers, 2012, 87(2): 995-1012. DOI:10.1016/j.carbpol.2011.09.063.

[6] ZOU P, YANG X, WANG J, et al. Advances in characterisation and biological activities of chitosan and chitosan oligosaccharides[J].Food Chemistry, 2016, 190: 1174-1181. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.06.076.

[7] BOUAZIZ F, HELBERT C B, ROMDHANE M B, et al. Structural data and biological properties of almond gum oligosaccharide:application to beef meat preservation[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 72: 472-479. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2014.08.044.

[8] 李拖平, 李蘇紅, 宋玉蓉, 等. 山楂果膠寡糖及其復合物對枯草桿菌的抗菌作用[J]. 食品工業科技, 2012, 33(10): 154-156.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.10.060.

[9] DI Rong, VAKKALANKA M S, ONUMPAI C, et al. Pectic oligosaccharide structure-function relationships: prebiotics, inhibitors of Escherichia coli O157: H7 adhesion and reduction of Shiga toxin cytotoxicity in HT29 cells[J]. Food Chemistry, 2017, 227: 245-254.DOI:10.1016/j.foodchem. 2017.01.100.

[10] LIU Xiaoli, XIA Wenshui, JIANG Qixing, et al. Effect of kojic acidgrafted-chitosan oligosaccharides as a novel antibacterial agent on cell membrane of Gram-positive and Gram-negative bacteria[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2015, 120(3): 335-339. DOI:10.1016/j.jbiosc.2015.01.010.

[11] 金山. 山楂果膠寡糖的分離制備及其抗菌特性的研究[D]. 哈爾濱:東北農業大學, 2008: 21.

[12] 李大峰, 賈冬英, 陳瀟, 等. 柚皮果膠水解物的抗菌活性研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2010, 32(2): 63-65. DOI:10.14188/j.ajsh.2010.02.013.

[13] 張曉璐. 阿奇霉素分散片人體藥代動力學研究及生物等效性評價[D].沈陽: 中國醫科大學, 2006: 12.

[14] 劉奕, 費偉, 王麗娜, 等. 人工合成抗菌肽對口腔細菌抗菌性能的初步研究[J]. 華西口腔醫學雜志, 2014, 32(6): 601-605. DOI:10.7518/hxkq. 2014.06.017.

[15] DE SOUSA GUEDES J P, DA COSTA MEDEIROS J A, DE SOUZA SILVA R S, et al. The efベcacy of Mentha arvensis L. and M. piperita L.essential oils in reducing pathogenic bacteria and maintaining quality characteristics in cashew, guava, mango, and pineapple juices[J].International Journal of Food Microbiology, 2016, 238: 183-192.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2016.09.005.

[16] LIU Guorong, REN Guimei, ZHAO Lei, et al. Antibacterial activity and mechanism of biベdocin A against Listeria monocytogenes[J]. Food Control, 2017, 73: 854-861. DOI:10.1016/j.foodcont.2016.09.036.

[17] 馮亞凈, 張媛媛, 王瑞鑫, 等. 五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理及效果[J]. 食品與發酵工業, 2016, 42(2): 72-76. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602013.

[18] DIAO Wenrui, HU Qingping, ZHANG Hong, et al. Chemical composition, antibacterial activity and mechanism of action of essential oil from seeds of fennel (Foeniculum vulgare Mill.)[J]. Food Control, 2014, 35(1): 109-116. DOI:10.1016/j.foodcont.2013.06.056.

[19] KNAUTH P, PASQUINI L, DI VONA M L. Comparative study of the cation permeability of protonic, anionic and ampholytic membranes[J].Solid State Ionics, 2017, 300: 97-105. DOI:10.1016/j.ssi. 2016.12.015.[20] Lü Fei, LIANG Hao, YUAN Qipeng, et al. In vitro antimicrobial effects and mechanism of action of selected plant essential oil combinations against four food-related microorganisms[J]. Food Research International, 2011, 44(9): 3057-3064. DOI:10.1016/j.foodres.2011.07.030.

[21] HU Q, ZHOU B, DANG P, et al. Facile colorimetric assay of alkaline phosphatase activity using Fe (Ⅱ)-phenanthroline reporter[J].Analytica Chimica Acta, 2017, 950: 170-177. DOI:10.1016/j.aca.2016.11.012.

[22] MALANOVIC N, LOHNER K. Gram-positive bacterial cell envelopes: the impact on the activity of antimicrobial peptides[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2016, 1858(5):936-946. DOI:10.1016/j.bbamem.2015.11.004.

[23] 張赟彬, 劉笑宇, 姜萍萍, 等. 肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機理研究[J]. 現代食品科技, 2015, 31(5): 31-35;11. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.5.006.

[24] COX S D, MANN C M, MARKHAM J L, et al. Determining the antimicrobial actions of tea tree oil[J]. Molecules, 2001, 6(2): 87-91.DOI:10.3390/60100087.

[25] BAJPAI V K, SHARMA A, BAEK K H. Antibacterial mode of action of Cudrania tricuspidata fruit essential oil, affecting membrane permeability and surface characteristics of food-borne pathogens[J]. Food Control, 2013, 32(2): 582-590. DOI:10.1016/j.foodcont.2013.01.032.

[26] SHEN Suxia, ZHANG Tiehua, YUAN Yuan, et al. Effects of cinnamaldehyde on Escherichia coli and Staphylococcus aureus membrane[J]. Food Control, 2015, 47: 196-202. DOI:10.1016/j.foodcont.2014.07.003.

[27] SHARMA A, BAJPAI V K, BAEK K H. Determination of antibacterial mode of action of Allium sativum essential oil against foodborne pathogens using membrane permeability and surface characteristic parameters[J]. Journal of Food Safety, 2013, 33(2): 197-208. DOI:10.1111/jfs.12040.

[28] LONG M, WANG J, ZHUANG H, et al. Performance and mechanism of standard nano-TiO2(P-25) in photocatalytic disinfection of foodborne microorganisms: Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes[J]. Food Control, 2014, 39: 68-74. DOI:10.1016/j.foodcont. 2013.10.033.

[29] PRAMANIK K, GHOSH P K, RAY S, et al. An in silico structural,functional and phylogenetic analysis with three dimensional protein modeling of alkaline phosphatase enzyme of Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology,2017, 15(2): 527-537. DOI:10.1016/j.jgeb.2017.05.003.

[30] ZHENG H, WU W T, LIAO J M, et al. Studies on isolation and purification of (+)-abscisic acid from Botrytis cinerea[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2002, 27(10): 589-591. DOI:10.13461/j.cnki.cja.002637.