流式細胞術在超高壓誘導大腸桿菌O157:H7亞致死研究中的應用

孔曉雪，韓衍青，付 勇，姬賽賽，王嫻靜，禹金龍，江 蕓,*

大腸桿菌O157:H7是最常見的食源性致病菌之一，在世界范圍內普遍存在，廣泛分布于水、土壤和食物中，肉類、蔬菜、水果等均可成為傳染源[1-3]，目前已被WHO列為食品中四大食源性致病菌之一。我國食源性疾病監測網近年的資料顯示，我國在生肉、熟肉、蔬菜中均受到大腸桿菌O157:H7不同程度的污染，尤其是在生牛肉中感染幾率尤其高[4-5]，大腸桿菌O157:H7感染存有爆發的可能性，應引起高度重視[6-7]。

大腸桿菌O157:H7屬于革蘭氏陰性短桿菌，兼性厭氧，菌體兩端鈍圓，無芽孢，有周鞭毛，大多數菌株有莢膜；培養18～24 h后，菌落呈圓形凸起，邊緣齊整，直徑為1～15 mm，是腸出血性大腸桿菌的主要病原血清型，同時也是一種重要的人畜共患病原菌[8]。

流式細胞術（flow cytometry，FCM）可以對被熒光染色的單個細胞或生物顆粒進行多參數、快速定量分析，可以通過檢測熒光信號監測細胞膜完整性、細胞生理代謝活動、細胞凋亡周期、膜電位等細胞特性并分選出特定狀態的細胞群體[9]。熒光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，不能通過完整的細胞膜，但能穿過破損的細胞膜而對核染色。PI-DNA復合物的激發和發射波長分別為535 nm和615 nm。SYBR Green Ⅰ是一種可以透過完整細胞膜結合于所有DNA雙螺旋小溝區域的綠色熒光染料。在游離狀態下，SYBR Green Ⅰ發出微弱的熒光，與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強，SYBR Green Ⅰ的激發波長和發射波長分別為497 nm和520 nm[10-12]。

超高壓（high hydrostatic pressure，HHP）處理可有效抑制食品中的腐敗菌和致病菌，是目前食品工業運用最廣泛的非熱加工技術之一，其殺菌機制主要與細菌細胞膜破壞、核酸結構變化、胞內蛋白質變性、關鍵酶活性降低等有關[13-15]。超高壓處理后的微生物細胞存在3 種不同生理狀態：即正常細胞、處于損傷狀態的細胞（亞致死細胞）和死亡細胞[16-17]。1951年Hartsell最先將亞致死菌定義為一種在營養豐富的非選擇性培養基上能生長出正常菌落，而在選擇性培養基上無法生長出可見菌落的微生物的存在狀態，非選擇性培養基和選擇性培養基之間菌落數的差值，即為亞致死狀態菌的數目[18]。在超高壓處理過程中部分大腸桿菌O157:H7會處于亞致死狀態，流式細胞儀可以將不同生理狀態的細菌有效檢出，避免傳統培養方法在檢測亞致死菌過程中容易出現假陰性、造成漏檢、錯檢的情況，本研究采用PI和SYBR Green Ⅰ雙染色法結合流式細胞術對超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌體細胞不同的存活狀態及細胞膜完整性進行分析研究，以此評估通過單純超高壓殺菌處理是否可以有效避免大腸桿菌O157:H7帶來的食品安全隱患，并在此基礎上進一步證實超高壓處理后菌體細胞死亡機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌O157:H7由中國工業微生物菌種保藏中心提供（編號CICC 21530）。

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（tryptic soy agar with yeast extract，TSA-YE）、山梨醇麥康凱瓊脂（CT-sorbitol MacConkey agar base，CT-SMAC） 北京陸橋技術有限責任公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 南京化學試劑有限公司；PI、SYBR GreenⅠ 美國Sigma公司；聚乙烯耐高壓包裝袋（240 mm×190 mm） 南京圣比澳生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UHPF/2L/600 MPa食品超高壓處理設備 包頭高新技術食品機械公司；絕對計數熒光微球 上海甄準生物科技有限公司；FACSCalibur型全自動流式細胞儀 美國BD公司；FR-300手壓式塑料薄膜袋封口機 特力包裝機械有限公司；2-16KL 高速冷凍離心機 美國Sigma公司；WGZ-2XJ細菌濁度計 上海昕瑞儀器儀表有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；ZQTY-70臺式振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；JSM-5610LV型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本電子株式會社；H-7650透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

取10 mL新鮮已滅菌的胰蛋白胨大豆肉湯，將大腸桿菌O157:H7單菌落接種于其上，37 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，再取活化好的菌懸液1 mL接種于50 mL已滅菌的新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯中，37℃、150 r/min振蕩培養菌種18 h至穩定期，4 ℃、8 000×g離心5 min，棄上清液，用已滅菌的pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體3 次，并將菌體重懸，用細菌濁度計調整菌懸液濃度至106CFU/mL，裝入無菌聚乙烯耐高壓包裝袋中，4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 超高壓處理

菌懸液樣品于25 ℃條件下超高壓（200、400、500 MPa）處理5 min（加壓處理時間不包括升、卸壓所用時間），處理介質為水。超高壓處理后的樣品立即于冰上保存。

1.3.3 流式細胞儀對健康菌和熱致死菌存活狀態的檢測

梯度混合健康菌和熱致死菌（1 0 0 ℃、30 min），混合后的活菌率為0%、25%、50%、75%、100%。向各組混合菌懸液中分別加入50 μL PI和1 μL SYBR GreenⅠ[19-20]，搖勻，37 ℃放置30 min。染色過程在避光條件下進行，染色結束后，4 ℃、8 000×g離心5 min，用PBS洗滌2 次，去除多余的染色劑，重新懸浮，加入絕對計數熒光微球用流式細胞儀檢測計數。細胞采集數為104，流速為600 個/秒，FL1通道收集SYBR GreenⅠ熒光，FL3通道收集PI熒光，作計數結果與梯度配比熱處理細胞的相關性分析，以驗證實驗方法的精確度。

1.3.4 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活狀態的檢測

經200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液中分別加入50 μL PI和1 μL SYBR GreenⅠ，搖勻，37 ℃放置30 min。染色過程在避光條件下進行，染色結束后，4 ℃、8 000×g離心5 min，用PBS洗滌2 次，去除多余的染色劑，重新懸浮，加入絕對計數熒光微球[21-23]用流式細胞儀檢測計數。細胞采集數為104，流速為600 個/秒，FL1通道收集SYBR GreenⅠ熒光，FL3通道收集PI熒光，采用Cell-Quest軟件采集數據。

1.3.5 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌落總數測定

無菌操作條件下各超高壓處理組樣品各1 mL用已滅菌的pH 7.0 PBS進行梯度稀釋，選擇合適的稀釋度分別用TSA-YE和CT-SMAC[24-25]進行平板涂布計數。平板計數操作按照GB 4789.2—2003《食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》進行。陽性對照組為未經超高壓處理的菌懸液樣品，陰性對照組為100 ℃沸水浴30 min，熱滅活的菌懸液樣品。

1.3.6 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7微觀形態變化

1.3.6.1 SEM觀察

收集未經超高壓處理以及分別經200、400、500 MPa超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌懸液80 mL，4 ℃、8 000×g離心5 min，收集菌體，加入預冷的2.5%戊二酸溶液4 ℃固定4 h，用無菌PBS（pH 7.4）漂洗3 次，經50%、70%、80%、90%的乙醇順序梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3 次，每次20 min。脫水后樣品用乙酸異戊酯置換3 次，每次20 min，置換后的樣品進行冷凍干燥，離子濺射儀鍍金（厚度約10 nm），樣品處理好后于JSM-5610LV型SEM觀察菌體結構變化[18,26]。

1.3.6.2 TEM觀察

收集未經超高壓處理以及分別經200、400、500 MPa超高壓處理后大腸桿菌O157:H7菌懸液80 mL，4 ℃、8 000×g離心5 min，收集菌體，加入預冷的2.5%戊二酸溶液4 ℃固定4 h，2%瓊脂預包埋，用無菌PBS（pH 7.4）漂洗2 次，2%鋨酸固定1 h，用無菌PBS（pH 7.4）漂洗3 次，經30%、50%、70%、90%、無水乙醇梯度脫水各1次，每次15 min，再用無水丙酮脫水2次，環氧樹脂Epon812包埋，梯度烘干，采用超薄切片機切成厚度為70 nm的樣品，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染于H-7650 TEM下觀察菌體內部的結構變化[18,26]。

1.4 數據統計分析

數據采用SPSS 17.0進行進行單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗（P＜0.05），對流式細胞儀數據用Flowjo 7.6.1進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 雙染色法精確度實驗

SYBR GreenⅠ可以透過完整細胞膜能進入活菌的胞內與核酸物質結合，PI不能透過完整細胞膜只能透過破損的細胞膜進入死菌胞內與核酸物質結合。但PI與核酸物質的親和性優于SYBR GreenⅠ，一旦進入胞內可以取代SYBR GreenⅠ的結合位點；SYBR GreenⅠ的發射波長與PI的激發波長相近，當兩種熒光物質同時存在時，在熒光共振能量轉移作用下會使綠色熒光減弱，紅色熒光增強[10,27]，在這兩種作用下使得死菌只顯示紅色熒光，而活菌顯示綠色熒光。通過流式細胞儀分選不同熒光信號的細胞并對其計數，計算活菌/死菌比例與梯度配比做相關性驗證。

實驗結果表明SYBR GreenⅠ與PI雙染色法能夠將活菌/死菌梯度配比溶液中的活菌和死菌有效區分開。在梯度配比溶液中加入絕對計數微球后能精確對顯示不同熒光顏色的細胞計數，按計數結果計算顯示綠色熒光的細胞（FL1通道收集的細胞）占總細胞（FL1通道與FL3通道收集的細胞之和）的比例（y），其結果與梯度配比中健康菌所占比例（x）幾乎一致，（y＝0.994 7x，R2＝0.997 9），表明流式細胞儀雙染色法能夠準確鑒別大腸桿菌O157:H7的死活狀態并對死、活菌分別精確計數。

2.2 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活狀態檢測結果

圖1 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7雙染后流式細胞二維點圖Fig. 1 Flow cytrometric ぼuorescence dot plots for E. coli O157:H7 subjected ti different pressure treatments

經超高壓處理后大腸桿菌O157:H7流式細胞儀雙染色結果如圖1所示。門Q1內的菌顯示綠色熒光是只能被SYBR GreenⅠ染色的存活菌具有完整的細胞膜。門Q2內的菌同時顯示綠色熒光和紅色熒光（圖中未能顯示，后同）為損傷菌，損傷菌能同時顯示綠色熒光和紅色熒光是因為這部分菌細胞膜出現損傷使一部分PI進入胞內，但由于細胞膜只是部分損傷進入胞內的PI量較少，不足以完全取代SYBR GreenⅠ與核酸物質結合，所以使這部分細胞同時顯示綠色熒光與紅色熒光[10]。門Q3內的菌是被PI染色顯示紅色熒光的死亡菌。門Q4內的菌是少量沒有被染色劑染色的菌，沒有熒光信號或信號很弱。

經200 MPa處理后60.3%的菌在門Q1內，18.7%的菌在門Q2內，19.3%的菌在門Q3內，1.2%的菌在門Q4內，結果表明經200 MPa處理60.3%的菌具有完整細胞膜不能被PI染色，18.7%的菌細胞膜出現破損同時被PI與SYBR GreenⅠ染色，19.3%的菌細胞膜的選擇透過性完全喪失，使大量PI透過細胞膜進入胞內而使細胞顯示紅色熒光，這部分菌通常被認為是死亡菌[10,27-28]。

經400 MPa處理后28.6%的菌在門Q1內，35.6%的菌在門Q2內，35.4%的菌在門Q3內，0.2%的菌在門Q4內，結果表明經400 MPa處理28.6%的菌具有完整細胞膜不能被PI染色，35.6%的菌細胞膜出現破損同時被PI與SYBR GreenⅠ染色，35.4%的菌是死亡菌。

經500 MPa處理后0.89%的菌在門Q1內，30.2%的菌在門Q2內，68.1%的菌在門Q3內，0.52%的菌在門Q4內，結果表明經500 MPa處理0.89%的菌具有完整細胞膜不能被PI染色，30.2%的菌細胞膜出現破損同時被PI與SYBR GreenⅠ染色，68.1%的菌是死亡菌。

2.3 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7傳統培養計數結果

經不同壓力處理后的大腸桿菌O157:H7采用傳統培養方法進行菌落計數。將各組菌液進行梯度稀釋，選擇3 個合適的稀釋度，分別吸取100 μL經選擇性培養基（CT-SMAC）和非選擇性培養基（TSA-YE）進行平板涂布培養，結果如表1所示。

表1 不同壓力處理后TSA-YE和CT-SMAC對大腸桿菌O157:H7平板涂布計數結果Table 1 Counts of E. coli O157:H7 undergoing different pressure treatments determined using TSA-YE and CT-SMAC

健康菌和損傷菌均能在非選擇性平板TSA-YE上培養，而選擇性平板CT-SMAC上只有健康菌可以生長，因此非選擇性平板上菌落數與選擇性平板上菌落數的差值可以反映損傷菌的菌體數量。不同壓力處理，2 種平板計數結果的差值不同，表明不同壓力水平處理產生的損傷狀態的菌體數量不同。超高壓處理后大腸桿菌O157:H7傳統計數結果可以驗證流式細胞儀雙染色法對超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活狀態檢測結果的準確性。

超高壓處理后大腸桿菌O157:H7傳統計數結果如表1所示。陽性對照組兩種培養基平板涂布計數結果無顯著差異，陰性對照組兩種培養基上都沒有檢出菌落。200 MPa下TSA-YE平板計數結果為5.2 lg（CFU/mL），CTSMAC平板計數結果為4.1 lg（CFU/mL），兩者差值表示亞損傷狀態菌的數量級，其差值為1.1 lg（CFU/mL）；400 MPa下TSA-YE平板計數結果為3.9 lg（CFU/mL），CT-SMAC平板計數結果為1.7 lg（CFU/mL），2 種平板計數結果的差值為2.2 lg（CFU/mL）；500 MPa下TSA-YE平板計數結果為1.8 lg（CFU/mL），CT-SMAC平板沒有檢出菌落，2 種平板計數結果的差值為1.8 lg（CFU/mL）。平板涂布計數結果與流式細胞儀雙染色法檢測結果相比，經超高壓處理后大腸桿菌O157:H7存活菌、亞損傷菌與死亡菌數量級分布是一致的。

2.4 SEM觀察超高壓處理后大腸桿菌O157:H7形態學變化

圖2 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7 SEM圖Fig. 2 Scanning electron microscopic images of E. coli O157:H7 treated with high hydrostatic pressure processing

由圖2可知，未經超高壓處理組細胞具有典型的桿狀外形，細胞體表面規整，邊緣光滑，細胞壁、細胞膜完整，細胞形態結構正常。經200 MPa處理后少量菌體出現表面凹陷，大部分菌體形態結構正常，菌體飽滿表面光滑。400 MPa處理后部分菌體出現表面凹陷，菌體表面出現褶皺，邊緣粗糙。500 MPa處理后大部分菌體外觀有顯著變化，菌體表面出現褶皺，邊緣粗糙，有內容物外泄。

2.5 TEM觀察超高壓處理后大腸桿菌O157:H7形態學變化

圖3 超高壓處理后大腸桿菌O157:H7 TEM圖Fig. 3 Transmission electron microscopic images of E. coli O157:H7 treated with high hydrostatic pressure processing

由圖3可知，未處理組大腸桿菌O157:H7菌體細胞結構完整、清晰。細胞壁邊緣整齊光滑，細胞壁與細胞質膜之間無明顯間隙，細胞質分布均勻，菌體呈較規則的桿狀，無明顯褶皺。200 MPa處理后的大腸桿菌O157:H7部分菌體開始出現細胞壁和細胞質膜局部分離，細胞中心出現大面積光透明區，電子密度較低的陰影區從中心向細胞質膜靠近，但大部分菌體依然呈較規則的桿狀，細胞質均勻分布。經400 MPa處理的大腸桿菌O157:H7，大部分菌體細胞嚴重變形，細胞壁和細胞質膜分離，層次不清，部分菌體細胞內部結構發生明顯變化，光透明區出現絲狀物。經500 MPa處理的大腸桿菌O157:H7，菌體細胞嚴重變形，菌體細胞壁和細胞質膜嚴重分離，且層次不清，電子密度較低的陰影區從中心向細胞質膜靠近，并凝集成塊，個別菌體細胞壁模糊不清，細胞膜破裂。菌體內部結構發生更明顯變化，光透明區出現大量輻射絲狀物，核糖體變的清晰可見。

本實驗采用SEM、TEM觀察和分析超高壓處理對大腸桿菌O157:H7形態結構的影響，結果表明，超高壓可導致大腸桿菌O157:H7外部形態、內部結構的顯著變化，對菌體細胞壁和細胞膜有顯著的破壞作用，且這種破壞作用隨壓力升高而增大，當壓力達到500 MPa時，細菌細胞壁、細胞膜幾乎被完全破壞，細胞嚴重變形。

3 討 論

對超高壓等外力作用后微生物菌體細胞的生理狀態研究能夠使我們更好地理解微生物世界。運用流式細胞術研究微生物細胞的死亡、存活和損傷狀態近年來得到學者的廣泛認可和關注，關于損傷菌的研究近幾年也日趨增多。本研究選擇SYBR-GreenⅠ、PI兩種生物學染料對超高壓處理后的食源性致病菌大腸桿菌O157:H7進行染色、流式細胞儀分析，并結合傳統培養方法和電子顯微鏡技術，有效揭示出超高壓對菌體細胞的破壞作用及其不同的生理生化特性。首先，通過健康菌/死菌梯度配比實驗驗證了SYBR GreenⅠ、PI雙染色流式細胞術對大腸桿菌O157:H7死活菌檢測計數的精確度，實驗結果表明雙染色流式細胞術能夠準確區分梯度配比混合菌液中的活菌和死菌，并對活菌和死菌能夠實現準確計數。其次，采用SYBR GreenⅠ、PI雙染色流式細胞術對經200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液進行流式細胞學檢測，分析不同壓力處理后菌體細胞的存活狀態。結果表明超高壓對大腸桿菌O157:H7有明顯的致死效果，并能使大腸桿菌O157:H7細胞膜出現明顯損傷，這一研究結果與Ananta等[29]關于Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103壓力致死機制的研究結果是一致的。在實驗壓力范圍內，隨壓力升高，大腸桿菌O157:H7細胞膜損傷程度增加，細菌細胞死亡率增加，在400 MPa下處于亞損傷狀態的細菌細胞最多，占細菌細胞總數的35.6%，在500 MPa壓力處理下也依然有30.2%的細菌細胞處于亞損傷狀態。同時對經200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液進行選擇性培養基（CT-SMAC）和非選擇性培養基（TSA-YE）平板涂布培養，結果與SYBR GreenⅠ、PI雙染色流式細胞術檢測結果一致，即使在500 MPa壓力處理下依然有一部分菌處于亞損傷狀態，這部分菌不能在CT-SMAC平板上生長，但可以在TSA-YE平板上生長。這一結果與Mariana[30]、Maresca[31]等的研究所揭示的結果相同。最后，通過SEM和TEM對經200、400、500 MPa超高壓處理的菌懸液進行形態學觀察，結果表明超高壓使大腸桿菌O157:H7細菌細胞變形，細菌細胞壁、細胞膜破裂，內部形態改變，這與前文流式細胞術的分析結果和陸海霞等[13]的研究在一定程度上所揭示的情況是一致的。

綜上所述，400 MPa以上的超高壓對大腸桿菌O157:H7有較好的致死作用，當處理壓力達到500 MPa時幾乎多有菌體都受到損傷或死亡，超高壓對細菌細胞膜的破壞作用很可能是其主要致死機制之一。即使在500 MPa壓力處理下依然有30.2%的菌處于亞致死狀態，這部分菌是否會在食品貨架期內帶來安全隱患尚需進一步評估。

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