超聲波、超高壓對白鰱魚肌肉脂肪氧合酶構象及酶活力的影響

王幫國，余振宇，林 琳，潘麗軍，姜紹通,*

我國是世界淡水漁業第一大國，2014年我國淡水魚類產量2 770.32萬 t，占我國魚類總產量的68.4%、占淡水水產品總產量的87.5%。白鰱因其肉質鮮嫩，含有豐富的蛋白質、氨基酸以及多不飽和脂肪酸等人體必需營養成分，并且具有生長周期短、抗病能力強、產量高等特點，是著名的四大家魚之一[1-3]。

土腥味是制約鰱魚工業化發展的重要因素，土腥味增強原因主要有兩個方面，一是由于白鰱魚體內豐富的多不飽和脂肪酸嚴重氧化生成的小分子醛、酮、醇揮發性成分；二是來源于白鰱魚養殖環境中物質在體內的堆積，導致白鰱魚腥味加重主要源于白鰱魚體內的脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）催化降解不飽和脂肪酸產生的各種揮發性物質引起的[4-6]。LOX是種氧化還原酶，能專一催化含順,順-1,4-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸，生成具有共軛雙鍵的不飽和脂酸的氫過氧化物，再經過催化氧化，裂解成揮發性醛、酮、醇類小分子化合物，對食品風味形成起到關鍵作用[7-9]。

白鰱魚肌肉LOX氧化會造成不飽和脂肪酸含量下降，魚腥味加重，同時傳統的化學和熱處理脫腥方法也會嚴重破壞魚肉品質和營養價值[10-11]。而非熱物理加工方法近年來在食品加工過程中逐漸占居主導地位，其中超聲波（ultrasonic wave，UW）和超高壓（ultra high pressure，UHP）逐漸受到廣大研究者的關注[12]。超聲波具有獨特的聲化學效應，作用于液體時，強大的拉應力把液體“撕開”成空洞，隨周圍介質的振動而破滅，破滅時周圍液體突然沖入氣泡而產生高溫、高壓，同時產生激波，使分子結構發生了改變，可廣泛應用于食品加工業[13-15]。超高壓能夠鈍化食品內源酶是因為高壓狀態下，生物體高分子立體結構中的氫鍵結合、疏水結合、離子結合等非共有結合發生變化，內源酶的生物大分子構象會改變，導致蛋白質結構改變與變形，使酶失活[16-19]。為研發新型脫腥工藝，保持白鰱魚貯藏、加工過程中的品質和營養價值，本研究以白鰱魚肉為原料，從中提取LOX，初步探究超聲波、超高壓新型非熱物理加工方法對白鰱魚肌肉LOX構象、活力的影響，為白鰱的土腥味控制和精深加工提供新型技術和實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱魚購于合肥市馬鞍山路家樂福超市，每條質量（1 100±200）g。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、硫酸銨、亞油酸、硼酸、硼砂、吐溫20等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

JJ-2型組織搗碎機 江蘇省金壇市城西崢嶸實驗儀器廠；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見光分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；超聲波清洗器上海杰理科技有限公司；YCB630/2.5 1L超高壓設備兵器工業第五二研究所；810 CD圓二色譜（circular dichroism，CD）儀 日本JASCO公司；RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 白鰱魚肌肉LOX提取

參照Gata等[20]方法稍加修改，將鮮活白鰱魚宰殺，置于冰袋中帶回實驗室，然后置于裝滿冰的冰盒中去頭、尾和內臟，用冷水洗凈，去脊骨和魚皮，手工采集背部白色肌肉；將新鮮肌肉置于組織搗碎機中，添加4 倍體積的50 mmol/L、pH 7.8磷酸鹽緩沖液（含2 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA，4 ℃），12 000 r/min勻漿1.5 min；勻漿后緩沖液進行冷凍離心（10 000×g，60 min），上清液按質量體積比13.4∶100加入研碎無水硫酸銨，溶解后離心（10 000×g，30 min），收集上清液并按質量體積比13.4∶100加入研碎無水硫酸銨，充分溶解后離心（10 000×g，30 min），收集20%～40%飽和組分，沉淀等量溶于磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.4）中，即粗酶液。

1.3.2 白鰱魚肌肉LOX活力、質量濃度測定

參照付湘晉[21]的方法采用紫外分光光度法測定酶活力：用吐溫20（最終添加量0.1 mL/100 mL）作為乳化劑，將亞油酸（終濃度10 mmol/L）分散在10 mmol/L硼酸緩沖液（pH 9.0）中，置于4 ℃冰箱中備用。250 μL上述底物和50 μL LOX粗酶液添加到1.7 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）中，立刻計時，測定其在234 nm波長處吸光度的增加量。吸光度每分鐘增加0.001定義為一個酶活力單位。

酶液質量濃度采用考馬斯亮藍法測定，標準品選用牛血清白蛋白。

1.3.3 白鰱魚肌肉LOX的CD檢測

CD光譜法可以有效分析蛋白質肽鍵中α-螺旋和β-折疊等二級結構含量，顯示蛋白質在不同條件下二級結構的整體變化，是分析蛋白質二級結構最常用的方法[22]。本研究采用Feng Liping等[15]方法稍加修改：以磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）作為空白對照，先將LOX粗酶液稀釋至0.1～0.2 mg/mL，CD光譜掃描范圍190～250 nm，樣品池光程1 mm，掃描速率100 nm/min，常溫（25 ℃）下重復掃描4 次，得到LOX粗酶液CD光譜，用平均摩爾橢圓率[θ]表示圓二色性，單位deg·cm2/mol。

1.3.4 白鰱魚肌肉LOX熒光光譜檢測

蛋白質中的芳香族氨基酸基團具有內源熒光性，在外加光源激發情況下會發射內源熒光，并且熒光光譜會隨著芳香族氨基酸基團位置和微環境的變化而發生改變，通過熒光光譜的變化可以用來分析蛋白三級結構的變化趨勢[23]。

以磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）作為空白對照，先將LOX粗酶液稀釋至0.01～0.05 mg/mL，用熒光光譜儀進行掃描，激發波長為295 nm，掃描波長為220～700 nm，速率240 nm/min，常溫（25 ℃）條件下重復掃描3 次。

1.3.5 白鰱魚肌肉LOX超聲波處理

量取1.5 mL白鰱魚肌肉LOX粗酶液在2 mL離心管中，分別在180、210、240、270、300 W超聲波條件下處理3 h；在300 W超聲波下分別處理1、2、3、4、5 h，溫度（20±5）℃，測定其酶活力、CD光譜、熒光光譜，研究白鰱魚肌肉LOX在不同超聲波條件下酶活力、二級結構、三級結構變化。

1.3.6 白鰱魚肌肉LOX超高壓處理

量取10 mL白鰱魚肌肉LOX粗酶液在聚乙烯袋中密封，分別在150、200、250、300、350、400 MPa超高壓條件下處理15 min；在300 MPa超高壓條件下分別處理5、10、15、20、25、30 min，溫度4 ℃，測定其酶活力、CD光譜、熒光光譜，研究白鰱魚肌肉LOX在不同超高壓條件下酶活力、二級結構、三級結構變化。

1.4 數據統計與分析

每組實驗進行3 組平行實驗，所有數據采用Excel軟件進行整理分析，測定結果以表示，采用SPSS軟件的單因素方差分析法進行顯著性分析，CD圖和熒光光譜圖采用Origin 9.0作圖軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理對白鰱魚肌肉LOX的影響

2.1.1 超聲波功率對白鰱魚肌肉LOX的影響

分別用180、210、240、270、300 W超聲波處理白鰱魚肌肉LOX 3 h后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖1～3所示。

圖1 超聲功率對白鰱魚肌肉LOX活力的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic power on LOX activity in silver carp muscle

由圖1可知，隨著超聲波功率增加，LOX活力逐漸下降，功率大于210 W時，酶活力下降較為顯著；當LOX經180、210、240、270、300 W超聲波處理3 h后，酶活力分別下降5.36%、16.07%、26.79%、50.00%、62.50%。

圖2 超聲功率對白鰱魚肌肉LOX二級結構構象的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

光學活性物質如蛋白質對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數（ε）是不相等的，吸收率不同，圓偏振光變成橢圓偏振光，其光吸收的差值ΔA稱為該物質的圓二色性[24]。蛋白質二級結構中主要的光活性基團是肽鏈骨架中的肽鍵，其吸收峰分布在蛋白質CD色譜的遠紫外區段（190～240 nm），一般認為α-螺旋特征吸收峰在208 nm和222 nm左右，有兩處負峰，在208 nm波長處橢圓率能夠反映蛋白質α-螺旋結構變化，估計蛋白質α-螺旋含量；典型β-折疊在214 nm左右有一特征吸收負峰；無規卷曲在220 nm左右有一小而寬的正峰[25-26]。圖2為白鰱魚肌肉LOX經不同功率超聲波處理后CD光譜圖。隨著超聲波功率增加，LOX在208、214 nm和222 nm波長處特征吸收峰強度逐漸下降，說明超聲波對LOX內α-螺旋、β-折疊等二級結構產生了一定影響，使LOX二級結構發生改變，功率越大，二級結構改變越明顯。

圖3 超聲功率對白鰱魚肌肉LOX三級結構構象的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

含有芳香族氨基酸殘基如色氨酸（tryptophan，Tr p）、酪氨酸（t y r o s i n e，Ty r）和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）殘基的蛋白質在一定激發波長照射下會產生熒光，稱為內源熒光[27]。Trp、Tyr和Phe的熒光峰位波長分別是344、303、282 nm，蛋白質的內源熒光主要是由Trp和Tyr殘基形成的，其中Trp的熒光強度最強；在同時含有Trp和Tyr的蛋白質中，由于其分子發生了從Tyr殘基到Trp殘基的能量轉移，從而導致Tyr殘基的熒光猝滅和Trp殘基的熒光強度增加，因而內源熒光分析的主要對象為Trp，常被用來研究蛋白質的三級結構變化[28-29]。

圖3為白鰱魚肌肉LOX經不同功率超聲波處理后熒光光譜圖。超聲波功率小于210 W時，LOX在344 nm波長處熒光強度變化較小，LOX三級結構相對穩定；當超聲波功率大于210 W時，說明隨著超聲波功率增加，LOX在344 nm波長處熒光強度明顯增強，說明LOX分子中Trp不斷由分子內非極性環境中暴露在外部極性環境中，LOX三級結構發生改變，且超聲波功率越大，三級結構變化越顯著。因此，白鰱魚肌肉LOX活性與LOX分子結構有著極為密切的聯系，增加超聲波功率、延長超聲時間能夠使白鰱魚肌肉LOX分子內的二級結構、三級結構發生變化，進而使LOX活性降低。

2.1.2 超聲處理時間對白鰱魚肌肉LOX的影響

用300 W超聲波分別處理白鰱魚肌肉LOX 1、2、3、4、5 h后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖4～6所示。

圖4 超聲時間對白鰱魚肌肉LOX活力的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic irradiation time on LOX activity in silver carp muscle

由圖4可知，隨著超聲時間延長，LOX活力呈下降趨勢，說明LOX逐漸失活；時間短于3 h時，隨著超聲時間酶活力下降較為明顯，大于3 h后趨于平緩。用300 W超聲波分別處理白鰱魚肌肉LOX 1、2、3、4、5 h后，酶活力分別下降26.79%、51.79%、66.07%、69.64%、76.79%。

圖5 超聲時間對白鰱魚肌肉LOX二級結構構象的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic irradiation time on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

圖5為白鰱魚肌肉LOX經300 W超聲波處理不同時間后CD光譜圖。隨著超聲時間延長，LOX在208、214 nm和222 nm波長處特征吸收峰強度逐漸下降，說明LOX內α-螺旋、β-折疊含量降低，二級結構發生變化，且隨著時間延長，二級結構變化越明顯。

圖6 超聲時間對白鰱魚肌肉LOX三級結構構象的影響Fig. 6 The effect of ultrasonic irradiation time on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

圖6為白鰱魚肌肉LOX經300 W超聲波處理不同時間后熒光光譜圖。隨著超聲時間延長，LOX在344 nm波長處熒光強度逐漸增強，超聲時間短于3 h時，LOX在344 nm波長處熒光強度變化趨勢相對平緩，大于3 h時，LOX在344 nm波長處熒光強度明顯增強，說明LOX分子中Trp不斷由分子內非極性環境中暴露在外部極性環境中，LOX三級結構發生改變，且超聲時間越長，三級結構變化越明顯。因此隨著超聲時間延長，白鰱魚LOX的二級、三級結構不斷改變，進而使LOX活力不斷降低。

2.2 超高壓處理對白鰱魚肌肉LOX的影響

2.2.1 超高壓壓力對白鰱魚肌肉LOX的影響

分別用150、200、250、300、350、400 MPa超高壓處理白鰱魚肌肉LOX 15 min后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖7～9所示。

圖7 超高壓壓力對白鰱魚肌肉LOX活力的影響Fig. 7 Effect of UHP pressure on LOX activity in silver carp muscle

如7圖所示，隨著超高壓壓力增加，LOX活力整體呈下降趨勢，在0～300 MPa之間，隨著壓力增加，酶活力下降顯著，壓力大于300 MPa時，酶活力趨于穩定，此時LOX已基本失活；用150、200、250、300、350、400 MPa超高壓處理白鰱魚肌肉LOX 15 min后，LOX活力分別下降46.55%、65.52%、75.86%、93.10%、96.55%、93.10%。

圖8 超高壓壓力對白鰱魚肌肉LOX二級結構構象的影響Fig. 8 Effect of UHP pressure on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

圖8為白鰱魚肌肉LOX經不同壓力超高壓處理15 min后CD圖。隨著超高壓壓力增大，LOX在208、214 nm和222 nm波長處特征吸收峰強度明顯下降，說明LOX內α-螺旋、β-折疊含量明顯下降，且隨著超高壓壓力增大，二級結構變化越顯著。

圖9 超高壓壓力對白鰱魚肌肉LOX三級結構構象的影響Fig. 9 Effect of UHP pressure on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

從圖9可以看出，隨著超高壓壓力增大，LOX在344 nm波長處熒光強度顯著減弱，這與大多數文獻中報道的結果并不相同。相關文獻報道，當含有芳香族殘基的蛋白質三級結構發生改變，一般情況下Trp不斷由分子內非極性環境中暴露在外部極性環境中，造成蛋白質在344 nm波長處熒光強度明顯增強[24,30]。但是本實驗結果出現相反的情況，熒光強度沒有出現增強反而顯著減弱，經查閱文獻并結合超高壓作用原理分析，主要原因可能是LOX分子內部的Trp殘基在超高壓作用下被進一步包埋在蛋白質側鏈中，肽鏈沒有展開，熒光基團沒有暴露，因此不會產生內源熒光，而且壓力越高，包埋作用越明顯，造成LOX在344 nm波長處熒光強度顯著減弱的現象[31]。這種現象并不是因為LOX三級結構未發生改變，而是由于超高壓的壓力作用導致Trp殘基的包埋所致。氨基酸殘基的包埋和暴露均會使帶有芳香族殘基的微環境發生改變，進而使酶的三級結構也發生改變。因此，隨著超高壓壓力的增加，LOX三級結構也在不斷變化，且壓力越大，變化越明顯。

2.2.2 超高壓時間對白鰱魚肌肉LOX的影響

用300 MPa超高壓分別處理白鰱魚肌肉LOX 5、10、15、20、25、30 min后，LOX活力、CD光譜圖、熒光光譜圖分別如圖10～12所示。

圖10 超高壓時間對白鰱魚肌肉LOX活力的影響Fig. 10 Effect of UHP processing time on LOX activity in silver carp muscle

如圖10所示，隨著超高壓時間延長，LOX活力整體呈下降趨勢，在0～20 min之間，酶活力下降顯著，壓力大于20 min時，酶活力趨于穩定，此時LOX已基本失活；用300 MPa超高壓分別處理白鰱魚肌肉LOX 5、10、15、20、25、30 min后，LOX活力分別下降60.34%、77.59%、87.93%、93.10%、93.10%、94.83%。

圖11 超高壓時間對白鰱魚肌肉LOX二級結構構象的影響Fig. 11 Effect of UHP processing time on the secondary conformation of LOX in silver carp muscle

圖11為白鰱魚肌肉LOX經300 MPa超高壓處理不同時間后CD圖。隨著超高壓時間延長，LOX在208、214 nm和222 nm波長處特征吸收峰強度顯著下降，說明LOX內α-螺旋、β-折疊含量明顯下降，蛋白質二級結構出現較大變化。而且隨著時間的延長，LOX在208、214 nm和222 nm波長處特征吸收峰強度在5 min時極為顯著顯的變化，5～30 min時，LOX的特征吸收峰強度呈逐漸降低的趨勢，結合超高壓作用機理，可以得出主要原因是超高壓作用使LOX分子構象改變主要發生在超高壓加壓和泄壓過程中，延長超高壓時間時，加壓和泄壓時間不變，只是維持穩壓的時間延長，因此變化趨勢相較于0～5 min明顯降低。

圖12為白鰱魚肌肉LOX經300 MPa超高壓處理不同時間后熒光光譜圖。隨著超高壓時間延長，LOX分子內部暴露出來的Trp在超高壓作用下又被包埋在蛋白質側鏈中，不會產生內源熒光，使LOX在344 nm波長處熒光強度顯著減弱，說明LOX三級結構出現明顯變化。隨著時間延長，包埋作用越明顯，LOX三級結構變化越顯著。因此，結合白鰱魚肌肉LOX活力與分子結構的變化趨勢可以明顯得出，LOX活性與其分子結構有著極為密切的聯系，增加超高壓壓力、延長超聲時間能夠使白鰱魚肌肉LOX分子內的二級結構、三級結構發生極為顯著的變化，進而使LOX活力大大降低。

圖12 超高壓時間對白鰱魚肌肉LOX三級結構構象的影響Fig. 12 Effect of UHP processing time on the tertiary conformation of LOX in silver carp muscle

3 結 論

本研究以白鰱魚肌肉LOX為原料，研究了其在不同超聲波和超高壓條件下酶活力、二級結構和三級結構變化規律。實驗結果顯示：隨著超聲波功率的增加、時間延長，二級結構和三級結構明顯發生變化，使LOX活力不斷降低，3 h后隨著超聲時間延長酶活力下降不明顯且能耗增加，所以選取最適超聲條件為300 W、3 h，但從酶活力變化趨勢可知，超聲波作用較為緩慢，時間較長，并且引起的熱效應明顯，因此超聲波可作為改變LOX構象，抑制LOX活力，改變白鰱魚肌肉多不飽和脂肪酸氧化調控的輔助條件；隨著超高壓壓力的增加、時間的延長，二級結構和三級結構發生顯著變化，LOX活力迅速降低，綜合考慮處理條件對酶活性的影響和能耗，選取最適超高壓條件為300 MPa、20 min。超高壓作用迅速、時間短，熱效應可忽略不計，因此超高壓可作為破壞LOX構象、抑制LOX活力、調控白鰱魚肌肉多不飽和脂肪酸氧化的重要條件；但其對設備要求較高，所以其用于工業化還有一段距離。本實驗的研究結果可為白鰱魚的土腥味控制和精深加工提供參考。

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