綠豆皮可溶性膳食纖維的抗氧化作用

羅 磊，王雅琪，馬麗蘋，朱文學*，張 寬，姬青華，關寧寧，薛依涵

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023）

綠豆（Phaseolus radiatus L.）在我國有兩千多年的栽培歷史，有清涼解毒、止瀉利尿、消熱解暑等功效。綠豆皮是指泡發綠豆后揉搓下來的種皮，中醫稱為綠豆衣，有報道指出綠豆的食療保健功能主要來自其種皮[1]，但目前綠豆皮多作為廢渣或飼料，而未被充分利用。綠豆皮中富含膳食纖維（dietary fiber，DF）、黃酮和生物堿等生物活性物質，其中DF含量高達65.85%[2]，有研究人員對綠豆皮中DF的提取[3]及結構[4]進行了研究。袁艷娟等[5]發現綠豆皮DF有較好的持水力和溶脹力；王倩等[6]研究了綠豆皮不溶性DF的提取及理化性質。而迄今為止，國內外對綠豆皮DF尤其是可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）功能性質方面的研究鮮見報道。

機體在代謝的過程中會產生大量的氧自由基，包括過氧化氫、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）等[7]，這些自由基使多種生物大分子氧化損傷，對基因的表達和調節系統產生影響，導致細胞轉錄水平降低而引起衰老甚至造成免疫失調。因此，研究如何有效清除或抑制自由基的產生對延緩衰老和預防疾病有重要的意義。Zhu Fengmei等[8]指出青稞麩皮DF具有抗氧化活性；王磊等[9]發現椪柑渣中SDF對·OH、O2-·和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基均表現出較強清除能力；另外，豆渣[10]和米糠[11]SDF的體外抗氧化活性均已得到證實，而針對綠豆皮中SDF抗氧化作用的研究鮮有報道。故本研究在對綠豆皮SDF體外清除自由基能力研究的同時，采用皮下注射D-半乳糖的方法誘導小鼠衰老模型[12]來研究綠豆皮SDF在體內的抗氧化作用，為綠豆皮SDF開發利用提供科學依據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮由洛陽新農村豆芽廠提供。

SPF級BALB/c小鼠共50 只，鼠齡8周，體質量（20±2）g，雌雄各半，由河南科技大學醫學院實驗動物中心從華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心代購，許可證號：SCXK-（鄂）2010-0009。

DPPH 上海伊卡生物技術有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總蛋白含量測定（二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法）試劑盒 南京建成生物工程研究所；冰醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、VC、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過氧化氫、水楊酸、D-半乳糖、氯化鈉等常用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HC-1000Y2高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿有限公司；HMB-701超微粉碎機 北京環亞天元機械技術有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機、TGL-20M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C pH計 上海越平科學儀器有限公司；101-2-BS電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；UV2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司；FA1004型電子分析天平 上海上平儀器公司；電子天平 常熟市金羊砝碼儀器有限公司；微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；玻璃勻漿器 江陰市精英玻璃制品廠。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮SDF的制備

綠豆皮經蒸餾水反復清洗、除雜后，在室溫下干燥至恒質量，后經高速粉碎機粉碎后過50 目篩，得到綠豆皮粗粉，然后放入超微粉碎機（1.5 kW）中粉碎，過400 目篩得到綠豆皮超微粉（此時樣品通過400 目篩而未通過500 目篩，粒徑為38～25 μm）。根據GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》[13]進行綠豆皮SDF制備，所得綠豆皮SDF固體放在40 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥，稱質量，得到綠豆皮SDF得率為9.52%，略高于李積華[14]采用改良的Southgate法測定綠豆皮SDF的含量（9.063%）。

1.3.2 綠豆皮SDF體外抗氧化作用1.3.2.1 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法[15]進行還原力的測定。用移液槍量取0.4 mL不同質量濃度（0.062 5～4.000 0 mg/mL）的樣品溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后在50 ℃水浴鍋中反應20 min，快速置于冰水中冷卻。再加入2.5 mL質量分數為10%的三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液，加入2.5 mL蒸餾水和質量分數為1%的FeCl3溶液0.5 mL，混勻后靜置10 min，在700 nm波長處測定其吸光度。用蒸餾水代替樣品做相同操作并以此為空白對照，VC作為陽性對照，做3 次平行實驗。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率計算

參考朱文學等[16]的方法，并稍作改動，配制不同質量濃度（0.062 5～4.000 0 mg/mL）的綠豆皮SDF溶液，用蒸餾水作為空白對照，在517 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照，重復3 組取平均值。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為DPPH溶液和不同質量濃度的樣品或VC混合溶液的吸光度；Aj為無水乙醇和不同質量濃度的樣品或VC混合溶液吸光度；Ac為DPPH溶液和蒸餾水混合溶液的吸光度。

1.3.2.3 ·OH清除率計算

參考Lai Furao等[17]的方法，并稍作改動，配制不同質量濃度（0.062 5～4.000 0 mg/mL）的綠豆皮SDF溶液，用蒸餾水作為空白對照，在510 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照，設3 組平行，取平均值。按式（2）計算·OH清除率。

式中：A1為FeSO4溶液、不同質量濃度的樣品或VC溶液、30% H2O2溶液（質量分數，下同）、水楊酸混合溶液的吸光度；A2為FeSO4溶液、不同質量濃度的樣品或VC溶液、30% H2O2溶液、無水乙醇混合溶液的吸光度；A0為FeSO4溶液、蒸餾水、30% H2O2溶液、水楊酸混合溶液的吸光度。

1.3.3 綠豆皮SDF對小鼠體內抗氧化作用

1.3.3.1 動物分組、造模與給藥

實驗期間，50 只小鼠分籠飼喂普通飼料，自由攝食和飲水，適應性培養1 周后隨機分為5 組：正常對照組、模型組、綠豆皮SDF低劑量組（200 μg/g）、中劑量組（400 μg/g）、高劑量組（600 μg/g），每組10 只，雌雄各半，模型組和綠豆皮SDF各劑量組小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖（200 mg/kg體質量）構建衰老小鼠模型，正常對照組注射等體積的生理鹽水。每日給藥1 次，連續給藥30 d，綠豆皮SDF各劑量組灌胃綠豆皮SDF溶液，灌胃體積為20 mL/kg體質量[18]，正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。

1.3.3.2 小鼠血清及肝組織樣品制備

給藥第30天小鼠空腹過夜，各組小鼠稱體質量后眼眶采血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min分離血清，取上清液，-20 ℃保存待測。小鼠取血后頸椎脫臼處死，快速取出肝臟，以冰生理鹽水洗去浮血，濾紙吸干，迅速稱質量。加入9 倍組織質量的已預冷生理鹽水（9 mg/mL），冰水浴條件下用玻璃勻漿器迅速研磨勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃保存待測。

1.3.3.3 檢測指標測定

按照相應試劑盒說明書分別對小鼠血清和肝組織總蛋白含量（BCA法）、T-AOC水平、CAT和T-SOD活力、MDA含量以及小鼠肝組織GSH-Px活力進行測定。T-AOC測定采用Fe3＋還原法，CAT活力測定采用鉬酸銨比色法，T-SOD活力通過黃嘌呤氧化酶法測定，MDA含量通過硫代巴比妥酸比色法進行測定，GSH-Px活力測定采用二硫對硝基苯甲酸法。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化作用

2.1.1 還原力測定結果

圖1 綠豆皮SDF還原力Fig. 1 Reducing power of SDF from mung bean hull

吸光度越高，還原力越強。由圖1可以看出，VC的還原力在質量濃度為250 μg/mL時已達到了2.063，之后無明顯變化。而綠豆皮SDF的還原力在0.062 5～4.000 0 mg/mL范圍內隨著質量濃度的增加而增大，當質量濃度為4 mg/mL時，還原力為1.526。在所考察的質量濃度范圍內，綠豆皮SDF的還原力不如VC。但與唐孝青等[19]通過浸提法得到梨渣SDF在質量濃度為4 mg/mL時的還原力0.845相比，綠豆皮SDF的還原力較強。

2.1.2 DPPH自由基清除效果

圖2 綠豆皮SDF對DPPH自由基的清除作用Fig. 2 Scavenging effect of SDF from mung bean hull against DPPH radicals

由圖2可知，V C對D P P H自由基的清除率在250 μg/mL時為99.32%，隨著質量濃度的增大其清除率逐漸趨于100%。綠豆皮SDF對DPPH自由基的清除能力呈現出劑量依賴性。當質量濃度為62.5 μg/mL和4 mg/mL時，其清除率分別為21.81%和82.65%。Yan Xiaoguang等[20]通過蒸汽爆破處理小麥麩皮后制備的SDF在5 mg/mL時對DPPH的清除率為87.15%，因此綠豆皮SDF表現出較強的DPPH自由基的清除能力。

2.1.3 ·OH清除效果

圖3 綠豆皮SDF對?OH的清除作用Fig. 3 Scavenging effect of SDF from mung bean hull against hydroxyl radicals

綠豆皮SDF對·OH清除能力結果如圖3所示，在質量濃度為0.062 5～4.000 0 mg/mL范圍內其清除率與質量濃度有明顯的量效關系。隨著SDF質量濃度的增大，綠豆皮SDF的·OH清除率也逐漸增大，從62.5 μg/mL時的17.45%到4 mg/mL時的85.16%，而VC的·OH清除率在500 μg/mL時已幾乎達到了100%。高辰等[21]利用噴霧劑壓結合酶對豆渣SDF進行提取并得出豆渣SDF在4 mg/mL時對·OH清除率為80%左右，進一步證實綠豆皮SDF具有較強清除·OH能力。

2.2 綠豆皮SDF對小鼠的抗氧化作用

2.2.1 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-AOC水平的影響

表1 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-AOC水平的影響Table 1 Effect of SDF from mung bean hull on T-AOC in serum and liver tissue of mice

綠豆皮SDF對小鼠T-AOC水平的影響如表1所示，模型組小鼠肝組織和血清T-AOC水平均極顯著低于正常對照組（P＜0.01），血清中SDF低、中劑量組也極顯著低于正常組，肝組織中只有SDF低劑量組極顯著低于正常組；與模型組相比，除SDF低劑量組小鼠血清T-AOC水平低于其模型組外，其余小鼠肝組織和血清中各劑量組T-AOC水平均極顯著高于模型組，說明中、高劑量的SDF能有效提高小鼠體內T-AOC水平。

2.2.2 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-SOD活力的影響

表2 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中T-SOD活力的影響Table 2 Effect of SDF from mung bean hull on T-SOD in serum and liver tissue of mice

由表2可知，模型組小鼠肝組織和血清T-SOD活力均極顯著低于正常對照組（P＜0.01）；與模型組相比，小鼠SDF低、中劑量組肝組織中T-SOD活力降低，但差異不顯著（P＞0.05），其余小鼠血清、肝組織中SDF各劑量組T-SOD活力均提高，其中小鼠SDF各劑量組血清中T-SOD活力與模型組差異極顯著（P＜0.01），小鼠SDF高劑量組肝組織中T-SOD活力與模型組差異顯著（P＜0.05）。

2.2.3 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中CAT活力的影響

表3 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中CAT活力的影響Table 3 Effect of SDF from mung bean hull on CAT activity in serum and liver tissue of mice

表3表明，模型組和SDF低劑量組小鼠肝組織和血清CAT活力均極顯著低于正常對照組（P＜0.01）；小鼠SDF各劑量組與模型組相比CAT活力均有一定的升高，除小鼠血清SDF高劑量組具顯著性（P＜0.05）外，其他各組小鼠SDF各劑量組與模型組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.4 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中MDA含量的影響

表4 綠豆皮SDF對小鼠血清和肝組織中MDA含量的影響Table 4 Effect of SDF from mung bean hull on MDA content in serumand liver tissue of mice

從表4可以看出，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織和血清MDA含量均極顯著增加（P＜0.01），SDF低、中劑量組小鼠肝組織中MDA含量升高且有極顯著、顯著差異；SDF各劑量組小鼠血清MDA含量較模型組均極顯著或顯著減少。

2.2.5 綠豆皮SDF對小鼠肝組織中GSH-Px活力的影響

表5 綠豆皮SDF對小鼠肝組織中GSH-Px活力的影響Table 5 Effect of SDF from mung bean hull on GSH-Px activity in liver tissue of mice

由表5可知，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織中GSH-Px活力均有所降低，但都不具顯著性差異（P＞0.05），小鼠SDF高劑量組GSH-Px活力較模型組差異顯著（P＜0.05）。

2.2.6 模型分析與討論

皮下注射大劑量的D-半乳糖使機體細胞內半乳糖質量濃度增高，在醛糖還原酶的催化下生成半乳糖醇，這種物質不能被細胞進一步代謝并不斷堆積，從而影響細胞滲透壓，導致細胞腫脹、功能喪失和代謝紊亂，最終導致衰老的發生[22-23]。機體通過酶系統和非酶系統產生氧自由基，酶系統中最主要的抗氧化酶T-SOD能夠催化O2-·發生歧化反應[24]，并能有效地清除自由基反應的啟動因子（O2-·）來抑制和阻斷自由基反應，降低自由基代謝產物（如MDA）的生成，從而達到清除自由基、抗衰老的作用[25]；CAT雖然不能直接清除·OH，但其可以分解體內·OH的前體過氧化氫，生成對人體無害的水來降低過氧化氫的濃度[26]，從而起到延緩衰老的作用；GSH-Px是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，對活性氧和組織產生的·OH及過氧化氫有較強的清除能力[27]，GSH-Px通過硒代半胱氨酸的形式發揮作用，以谷胱甘肽為還原劑來分解體內的脂質過氧化物，因此它可以使細胞膜與其他生物組織免受過氧化損傷[28]，GSH-Px也可與CAT協同作用，加速過氧化氫的分解來達到減少自由基和過氧化脂質形成的作用[29]；非酶系統中MDA能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用形成脂質過氧化物。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，還能通過脂類過氧化物的分解產物引起細胞損傷，因此MDA含量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映出細胞損傷即機體受自由基攻擊的嚴重程度[30]。

本研究通過D-半乳糖皮下注射（200 mg/kg）構建衰老動物模型來評估綠豆皮SDF粗提物的抗氧化活性。結果顯示與正常對照組相比，模型組小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力均有所降低，MDA含量大幅升高，且大部分差異顯著或極顯著，因此說明本研究衰老動物模型構建基本成功。

在衰老模型的基礎上進行綠豆皮SDF各劑量組對小鼠血清及肝組織的抗氧化能力影響的研究。綜合表1～5分析，與模型組比較，SDF各劑量組不同性別小鼠血清和肝組織中MDA含量表現出不同程度的降低，SDF低、中、高劑量組小鼠血清MDA含量分別降低了23.0%、25.5%、30.0%，肝組織中分別降低了14.4%、26.0%、48.3%，這可能是由于綠豆皮SDF能夠穩定細胞膜結構、抑制脂質過氧化從而有效地降低小鼠體內MDA含量。灌胃一定劑量的綠豆皮SDF后，小鼠低劑量組血清T-AOC水平、肝組織T-SOD活力及中劑量組肝組織T-SOD活力低于模型組，但均無顯著差異，這可能是由于低劑量的SDF對機體抗氧化作用不明顯且小鼠之間存在較大個體差異。隨著綠豆皮SDF劑量不斷增加，高SDF劑量組小鼠血清和肝組織T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力均顯著高于模型組，其中高劑量組小鼠血清T-AOC水平以及T-SOD、CAT活力分別提高了121%、63.3%、59.7%，而肝組織中血清T-AOC水平、T-SOD、CAT活力以及GSH-Px活力較模型組相比分別提高了104%、18.0%、63.0%、45.0%。同時，各劑量組小鼠血清和肝組織中T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力呈現出劑量相關性。由此可以看出，綠豆皮SDF尤其是高劑量的SDF具有一定的提高D-半乳糖衰老模型小鼠血清和肝組織中T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力和降低MDA含量的作用。

3 結 論

體外抗氧化實驗表明，綠豆皮SDF在質量濃度為4 mg/mL時，還原力為1.526，對DPPH自由基和·OH均表現出較強的清除率，分別為82.65%和85.16%。體內抗氧化實驗結果顯示，與正常對照組相比，不同性別模型組小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力均有所降低，MDA含量大幅升高，且大部分差異顯著（P＜0.05），說明本研究衰老動物模型構建基本成功；與模型組相比，各劑量組小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力呈現出劑量相關性。結果表明綠豆皮SDF能有效提高小鼠血清和肝組織中總蛋白含量、降低MDA含量，高劑量SDF可顯著提高小鼠血清和肝組織T-AOC水平以及T-SOD、CAT、GSH-Px活力。

綜上所述，綠豆皮SDF具有較強的清除自由基的能力，一定量的綠豆皮SDF能夠有效增強機體清除自由基的能力，因此綠豆皮SDF具有良好的抗氧化和延緩衰老的作用。

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