二十二碳六烯酸免疫調(diào)節(jié)活性

韓麗榮，魏碩名，王旭鋒，王春玲*

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是n-3系多不飽和脂肪酸[1]，目前主要的來源是深海魚油[2]。DHA純品是一種無色無味的脂溶性液體，低溫下具有較高的流動(dòng)性[3]。研究表明，DHA具有多種生理功能，如預(yù)防腦血栓[4]、促進(jìn)嬰幼兒的大腦發(fā)育[5-6]、抗炎[7]和抗癌[8]等。自研究證實(shí)了DHA的抗癌功能[9-10]，對于DHA其他的生物學(xué)功能也引起了人們的極大關(guān)注。

DHA是一種人體必需的脂肪酸[11]，人體無法自身合成，因此，DHA的生理功能成為了當(dāng)前的研究重點(diǎn)。在《美國高血壓》雜志上，澳大利亞西澳大學(xué)科學(xué)家Moili等[12]指出，DHA能使血液中膽固醇水平和血液黏稠度降低，使人體內(nèi)脂蛋白和血脂代謝得到調(diào)節(jié)，達(dá)到降血壓的目的。Calviello等[13]發(fā)現(xiàn)，DHA與5-氟尿嘧啶同時(shí)使用，能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。尤麗菊等[14]在DHA的藥理作用中提到，DHA含量增加，花生四烯酸含量降低，丙二醛生成減少，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性增加。賀敏等[15]證實(shí)了高含量二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）/DHA甘油三酯型可顯著改善免疫低下模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能，其免疫調(diào)節(jié)作用可能與其甘油三酯含量及EPA/DHA含量相關(guān)。但目前關(guān)于DHA免疫功能方面的研究主要是從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，而且僅對其免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了初步探討。

以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞為研究對象，采用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法、細(xì)胞染色法、相關(guān)酶活力的測定以及關(guān)鍵蛋白酶等方法，研究DHA的免疫調(diào)節(jié)活性，這將為DHA在食品和保健品中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7細(xì)胞株 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

DHA標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；MTT、吖啶橙（acridine orange，AO）染液、高效蛋白裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA） 北京索萊寶科技有限公司；中性紅 天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；糖原過碘酸希夫反應(yīng)（periodic acid Schiff reaction，PAS）染色液 北京雷根生物技術(shù)有限公司；酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）試劑盒、溶菌酶（lysozyme，LSZ）試劑盒、SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；pho-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體、pho-JNK/SAPK抗體、JNK/SAPK抗體、pho-p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs） 抗體、p38 MAPKs抗體、辣根過氧化物標(biāo)記IgG（H＋L）抗體 碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；紫外-可見分光光度儀、Multiskan GO酶標(biāo)儀、3110二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司；SU1510掃描電子顯微鏡 日本日立集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI-1640培養(yǎng)液與胎牛血清的比例為9∶1（V/V），必要時(shí)可加入0.1%青鏈霉素混合雙抗，4 ℃保存。

細(xì)胞凍存液：20%胎牛血清，70% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），現(xiàn)用現(xiàn)配。

MTT溶液配制：精確稱取MTT 50 mg溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液（pH 7.2），終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，0.22 μm水系濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。

中性紅溶液配制：用0.9%的生理鹽水使中性紅濃度為0.1%，0.22 μm水系濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。

DHA母液配制：將DHA標(biāo)準(zhǔn)品溶于DMSO中，配制成5 mg/mL的DHA溶液，-20 ℃避光保存，現(xiàn)稀釋現(xiàn)用。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）緩沖液（10×）：Tris 7.5 g、甘氨酸36.0 g、SDS 5.0 g，三蒸水定容至500 mL，4 ℃貯存，用時(shí)稀釋10 倍。

SDS凝膠上樣緩沖液（5×）：100 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）1.2 mL、10% SDS 4 mL、0.1%溴酚藍(lán)0.01 mL、20%甘油2 mL、三蒸水2.8 mL。

0.025 mol/L轉(zhuǎn)移電泳緩沖液（5×）：Tris 18.925 g、甘氨酸96.5 g，三蒸水定容至1 000 mL，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

洗滌緩沖液（Tris-buffered saline Tween 20，TBST）：Tris 4.84 g、NaCl 58.48 g，加三蒸水至2 000 mL，臨用前加入0.5 mL Tween 20，pH 7.5。

1.3.2 DHA增殖和吞噬活性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 DHA對RAW264.7增殖活性的影響

采用MTT法[16]測定DHA對RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，DHA作用RAW264.7細(xì)胞一定時(shí)間后，使用酶標(biāo)儀測定各孔570 nm波長處的吸光度。以不加DHA的為空白對照組。采用5 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理細(xì)胞，作為陽性對照組。細(xì)胞增殖率根據(jù)下式計(jì)算。

1.3.2.2 DHA對RAW264.7吞噬活性的影響

采用中性紅實(shí)驗(yàn)測定DHA對RAW264.7吞噬活性的影響，巨噬細(xì)胞所具有的吞噬活性，能將大分子的中性紅內(nèi)吞入細(xì)胞，當(dāng)用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的中性紅溶出，被吞噬的中性紅的量與540 nm波長處的吸光度成正比，因此可用此吸光值衡量巨噬細(xì)胞的吞噬能力。DHA作用細(xì)胞一定時(shí)間后，使用酶標(biāo)儀測定處各孔A540nm。

1.3.3 DHA對RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡觀察

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，以2.5%戊二醛溶液固定細(xì)胞2 h，依次以不同體積分?jǐn)?shù)（10%、30%、50%、70%、90%、90%、100%）的乙醇對細(xì)胞進(jìn)行脫水處理。取出蓋玻片，剪成適量大小粘于樣品臺(tái)，噴金后進(jìn)行電子顯微鏡掃描，觀察經(jīng)DHA作用后RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3.3.2 AO染色

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，細(xì)胞固定液（乙醇-冰醋酸-氯仿（6∶1∶3，V/V））固定細(xì)胞10 min，加入以1%乙酸溶液酸化后棄去液體，避光條件下加入0.01% AO染液染色20 min，以0.1 mol/L氯化鈣溶液分色1 min，PBS洗去殘留液。取出蓋玻片，置于潔凈載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.3.3 糖原PAS染色

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，用10%福爾馬林固定細(xì)胞30 min，加入過碘酸溶液室溫氧化5～8 min，流水沖洗蓋玻片后用蒸餾水浸洗，加入Schiff試劑室溫避光染色20 min，流水沖洗10 min。取出蓋玻片，置于潔凈載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.4 DHA對RAW264.7細(xì)胞酶活性的影響

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×104個(gè)/mL，以4 mL/瓶加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞充分貼壁。棄去培養(yǎng)液，空白對照組只加入培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入分別含有400、600、800、1000 ng/mL DHA的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、PBS清洗后離心收集，分別測定細(xì)胞ACP、LSZ和SOD的活力。

1.3.4.1 ACP活力測定

將細(xì)胞重懸于500 μL蒸餾水中，超聲破碎1 min，2 500 r/min離心10 min。用BCA蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白含量，樣品按照ACP測定試劑盒說明書操作，計(jì)算細(xì)胞中ACP的活力。

1.3.4.2 LSZ活力測定

將細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×106mL－1，超聲破碎1 min，2 500 r/min離心10 min。樣品按照溶菌酶測定試劑盒說明書操作，并計(jì)算細(xì)胞中LSZ的活力。

1.3.4.3 SOD活力測定

將細(xì)胞重懸于500 μL蒸餾水中，超聲破碎1 min，2 500 r/min離心10 min。用BCA蛋白測定試劑盒測定上清液蛋白含量，樣品按照SOD測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，并計(jì)算細(xì)胞中SOD的活力。

1.3.5 MAPKs蛋白激酶家族蛋白表達(dá)量的測定

采用Western Blot法測定RAW264.7細(xì)胞內(nèi)MAPKs家族蛋白的表達(dá)量。

1.3.5.1 蛋白樣品的制備

培養(yǎng)RAW264.7至充分貼壁后，吸出培養(yǎng)液，換為含DHA（0、600、800、1 000 ng/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)液。

培養(yǎng)結(jié)束，收集細(xì)胞并重懸于Hanks緩沖液中，1 000 r/min離心5 min，移棄管內(nèi)液體，重復(fù)漂洗2 次。

每管細(xì)胞中按照100:1的比例加入RIPA和蛋白酶抑制劑（phenylmethanesulfonyl ぼuoride，PMSF），冰浴中振蕩0.5 h。

轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/m離心20 min，吸取上清液蛋白提取液。

BCA蛋白法測定蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液，100 ℃煮沸3～5 min使蛋白變性，10 000 r/min離心5 min后即可上樣，上樣量為10～40 μL/孔（上樣蛋白質(zhì)量不低于50 μg）。

1.3.5.2 SDS-PAGE

按實(shí)驗(yàn)所需檢測的蛋白分子質(zhì)量，配制12%分離膠及5%濃縮膠。電泳時(shí)濃縮膠施加80 V電壓，待溴酚藍(lán)染料至下層分離膠處，電壓調(diào)至120 V，直至溴酚藍(lán)染料接近膠體底部，此過程大約需要1.5～2.0 h。

轉(zhuǎn)移電泳：將濾紙和NC膜裁剪成與電泳凝膠相同大小，用預(yù)冷并加入甲醇的轉(zhuǎn)移電泳緩沖液平衡約15 min。電轉(zhuǎn)前，利用NC膜、濾紙及分離膠膠制作“三明治”結(jié)構(gòu)：首先，剝棄濃縮膠，將剝離下來的分離膠蓋于已平衡的三層濾紙上，安裝電泳轉(zhuǎn)移槽，300 mA轉(zhuǎn)移1.5～2.0 h。

雜交：脫脂奶粉溶液封閉膜、T B S T溶液洗膜、一抗4 ℃孵育過夜、TBST溶液洗膜、二抗室溫孵育1 h、TBST溶液洗膜、免疫印跡化學(xué)發(fā)光液（electrochemiluminescence reagent，ECL）顯色NC膜、顯影液顯影、定影液定影，并拍照記錄數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DHA增殖和吞噬活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 DHA對RAW264.7增殖活性的影響

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有多種免疫功能，如吞噬外來的小顆粒物質(zhì)、呈遞抗原、分泌細(xì)胞因子等。一般情況下巨噬細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，吞噬能力很弱，當(dāng)受到一些免疫增強(qiáng)劑激活以后，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)增殖、吞噬及胞飲能力[17]。

圖1 DHA作用質(zhì)量濃度對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響Fig. 1 Effect of DHA concentration on proliferation index of RAW264.7 cells

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度的DHA與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的增殖能力均有所增加，但其對應(yīng)質(zhì)量濃度的增殖能力均小于共培養(yǎng)48 h后的增殖能力。陽性對照組中，經(jīng)過LPS處理細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力增加最顯著，說明RAW264.7細(xì)胞處于正常可被激活的狀態(tài)。共同培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，在給藥800 ng/mL時(shí)，增殖能力達(dá)到頂峰，細(xì)胞增殖率為73.03%；在1 000 ng/mL時(shí)，細(xì)胞增殖能力有所下降，但同空白對照組相比，細(xì)胞仍表現(xiàn)為增殖作用。共培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞，由于細(xì)胞營養(yǎng)條件的限制，隨著作用劑量的增加，細(xì)胞數(shù)量增幅較小。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，DHA與RAW264.7細(xì)胞的最佳作用時(shí)間為48 h，最佳作用劑量為800 ng/mL，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定DHA的作用時(shí)間為48 h。

2.1.2 DHA對RAW264.7吞噬活性的影響

通過對DHA作用后RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅能力的測定，判斷DHA對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響。

圖2 DHA作用質(zhì)量濃度對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響Fig. 2 Effect of DHA concentration on phagocytic activity of RAW264.7 cells

如圖2所示，當(dāng)DHA質(zhì)量濃度為800 ng/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞吞噬活性最高。中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)初步說明DHA能夠激活RAW264.7細(xì)胞，通過提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力來發(fā)揮DHA的免疫活性，執(zhí)行各種免疫防御功能，且在一定的質(zhì)量濃度范圍（0～1 000 ng/mL）內(nèi)，RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性與DHA具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

2.2 DHA對RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

巨噬細(xì)胞存在不同的形態(tài)和功能等級(jí)，在受到外源因素作用的情況下，巨噬細(xì)胞從靜息狀態(tài)變成活化狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)及功能會(huì)發(fā)生明顯變化。

圖3 DHA作用RAW264.7細(xì)胞的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 3 SEM images showing the microstructure of RAW264.7 treated with DHA

由圖3可知，以800 ng/mL的DHA作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞體積增大，表面突起明顯，貼壁面積明顯增大，褶皺增加，并有部分偽足出現(xiàn)；而空白對照未經(jīng)激活的細(xì)胞體積較小，形狀規(guī)則，細(xì)胞表面突起較小。以上結(jié)果表明RAW264.7細(xì)胞在800 ng/mL的DHA作用下，外部形態(tài)已呈現(xiàn)明顯的活化特征。

2.2.2 AO染色結(jié)果

采用AO染色觀察經(jīng)DHA作用后，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA代謝情況。AO是一種能和細(xì)胞中的核酸相結(jié)合并產(chǎn)生特異性熒光的染料[18]，能與細(xì)胞核內(nèi)的DNA和RNA結(jié)合，呈綠色熒光。

圖4 DHA作用RAW264.7細(xì)胞的AO染色圖（×400）Fig. 4 AO staining of RAW264.7 treated with DHA (× 400)

圖4表明，對照組細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，細(xì)胞呈圓形，形狀規(guī)則、大小均勻、體積較小，DHA作用組細(xì)胞體積變大、數(shù)目增多，細(xì)胞核區(qū)的綠色熒光亮度增強(qiáng)，說明在DHA作用下，RAW264.7細(xì)胞被激活，細(xì)胞核酸代謝旺盛。

2.2.3 糖原PAS染色結(jié)果

圖5 DHA作用RAW264.7細(xì)胞的PAS染色圖（×400）Fig. 5 PAS staining of RAW264.7 treated with DHA (× 400)

RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的糖原變化情況采用Schiff’s法檢測[19]。由圖5可知，細(xì)胞質(zhì)中的糖原經(jīng)DHA作用后被染成紫紅色，與對照組細(xì)胞相比，DHA作用組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色加深，細(xì)胞總數(shù)明顯增多，細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步分化，不規(guī)則程度加深。當(dāng)DHA質(zhì)量濃度為600 ng/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)糖原被紫紅色濃染，表明細(xì)胞內(nèi)糖原代謝加快；當(dāng)DHA質(zhì)量濃度為800 ng/mL時(shí)，視野內(nèi)梭形細(xì)胞聚集，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多。以上結(jié)果表明，DHA能通過促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)糖原代謝加快細(xì)胞的分化。

2.3 DHA對RAW264.7細(xì)胞酶活性的影響

2.3.1 DHA對RAW264.7細(xì)胞ACP活性的影響

酸性磷酸酶是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，能在第一時(shí)間反應(yīng)巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)。酸性磷酸酶形成的水解酶體系通過參與巨噬細(xì)胞的多種溶酶體消化功能，能夠破壞和消除侵入機(jī)體的異物，達(dá)到機(jī)體防御的功能[20]。

圖6 DHA質(zhì)量濃度對RAW264.7細(xì)胞ACP活性的影響Fig. 6 Effect of DHA concentration on ACP activity in RAW264.7 cells

由圖6可見，與對照組相比，當(dāng)400 ng/mL DHA作用于RAW264.7細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)ACP活力極顯著升高，繼續(xù)增加DHA的質(zhì)量濃度，細(xì)胞ACP活力也隨之增強(qiáng)。當(dāng)DHA質(zhì)量濃度為800 ng/mL時(shí)，ACP活力達(dá)到最大值123 U/g pro，是對照組酶活力的2.20 倍。以上結(jié)果表明，DHA能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌ACP，提高細(xì)胞的吞噬、殺菌能力。

2.3.2 DHA對RAW264.7細(xì)胞LSZ活性的影響

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是一種廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中的能水解細(xì)菌或真菌的胞壁多糖的堿性蛋白[21]。細(xì)菌或真菌的細(xì)胞壁經(jīng)溶菌酶水解后，菌體滲透壓失衡發(fā)生破裂，溶菌酶起到了破壞和消除入侵機(jī)體異物的作用，擔(dān)負(fù)著機(jī)體的防御功能，溶菌酶活性的強(qiáng)弱也反映了巨噬細(xì)胞的活化能力。

圖7 DHA質(zhì)量濃度對RAW264.7細(xì)胞LSZ活力的影響Fig. 7 Effect of DHA concentration on LSZ activity in RAW264.7 cells

由圖7可見，與對照組相比，各劑量組RAW264.7細(xì)胞的溶菌酶活力極顯著增強(qiáng)，在作用質(zhì)量濃度為400～800 ng/mL的范圍內(nèi)，細(xì)胞中溶菌酶的活力隨DHA作用質(zhì)量濃度的增加而增加，呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，并在800 ng/mL時(shí)活力達(dá)到最大值。以上結(jié)果表明，DHA能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生溶菌酶。

2.3.3 DHA對RAW264.7細(xì)胞SOD活性的影響

SOD是細(xì)胞內(nèi)存在的一種抗氧化酶，它能催化超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)從而減少其在體內(nèi)的累積，降低對機(jī)體的損傷，是自由基清除體系和機(jī)體代謝的關(guān)鍵酶[22]。

圖8 DHA質(zhì)量濃度對RAW264.7細(xì)胞SOD活力的影響Fig. 8 Effect of DHA concentration on SOD activity in RAW264.7 cells

由圖8可見，在實(shí)驗(yàn)劑量下，D H A可以刺激RAW264.7細(xì)胞，使細(xì)胞SOD活力與對照組相比呈極顯著增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度在400～800 ng/mL范圍內(nèi)時(shí)，作用效果具有劑量依賴，細(xì)胞代謝能力隨著作用劑量的增加逐步提高，細(xì)胞處于活化狀態(tài)。

測定經(jīng)不同濃度DHA作用RAW264.7細(xì)胞后細(xì)胞中酸性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的酶活，可知DHA能顯著增加RAW264.7細(xì)胞相關(guān)酶的分泌及活性、提高細(xì)胞殺菌、代謝及抗氧化能力，奠定了巨噬細(xì)胞活化的基礎(chǔ)。

2.4 DHA對RAW264.7細(xì)胞MAPKs相關(guān)蛋白的影響

MAPKs是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[23-25]。大量研究證實(shí)，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞分裂、分化、增殖和凋亡等多種生命體代謝活動(dòng)。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中三個(gè)經(jīng)典通路分別是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38 MAPKs和應(yīng)激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路[26-27]。磷酸化的ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)Elk-1、ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、維持形態(tài)特征等多種生命體代謝活動(dòng)[28-29]。此外，p38 MAPKs的激活與控制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因表達(dá)密切相關(guān)[30]。JNK蛋白被環(huán)境壓力或某些免疫相關(guān)細(xì)胞因子激活，在免疫系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)中起至關(guān)重要的作用[31-32]。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到外部刺激處于激活狀態(tài)時(shí)，MAPKs相關(guān)蛋白就會(huì)出現(xiàn)磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)NO和細(xì)胞因子的分泌[33-34]。因此，探究DHA對RAW264.7細(xì)胞中MAPKs通路中的蛋白變化情況，對闡述DHA對巨噬細(xì)胞的激活作用具有十分重要的意義。

圖9 DHA處理后RAW264.7細(xì)胞中MAPKs相關(guān)蛋白的變化情況Fig. 9 Effect of DHA on the expression of MAPKs signaling proteins in RAW264.7 cells

RAW264.7細(xì)胞MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路結(jié)果如圖9所示，正常細(xì)胞組中，ERK1/2蛋白磷酸化程度較低，而p38和JNK蛋白磷酸化程度很低。使用600～800 ng/mL的DHA單獨(dú)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)，ERK1/2、p38和JNK的磷酸化程度明顯升高，并且在800 ng/mL時(shí)磷酸化程度最高，到1 000 ng/mL時(shí)出現(xiàn)了下降。結(jié)果表明：DHA能夠引起ERK1/2、p38和JNK出現(xiàn)一定程度的磷酸化，說明DHA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活部分依賴了MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3 討 論

DHA具有多種生理功能，對人體的健康有著至關(guān)重要的作用，已有相關(guān)研究表明DHA在增加膜離子滲透率、增加細(xì)胞膜流動(dòng)性、降低膜膽固醇含量、抗炎等多方面均有一定功效[35]。國內(nèi)外對于DHA的研究主要集中在DHA的抗癌活性上，而有關(guān)DHA免疫活性的研究相對較少。本實(shí)驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對象，研究DHA的體外免疫活性。

巨噬細(xì)胞是一種最具有典型性的效應(yīng)細(xì)胞，能夠參與機(jī)體的非特異性免疫以及特異性免疫。當(dāng)巨噬細(xì)胞遭受到外來的抗原刺激之后，能夠發(fā)揮其免疫效應(yīng)，其本身的吞噬能力會(huì)自發(fā)提高，檢測其吞噬能力對了解巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有重要意義。MAPKs蛋白通路是參與細(xì)胞生長、增殖和分化等多種生理活動(dòng)的重要信號(hào)通路。研究證實(shí)[36]，DHA濃度為20 μmol/L時(shí)，能夠抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2的滅活作用，同時(shí)顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的p38和ERK1/2的mRNA表達(dá)。

在本研究中，DHA作為一種人體必需的多不飽和脂肪酸，在較低質(zhì)量濃度時(shí)（0～1 000 ng/mL），能夠促進(jìn)RAW264.7的細(xì)胞增殖和吞噬活性，并具有明顯的濃度依賴關(guān)系。同時(shí)，DHA能夠增強(qiáng)細(xì)胞中相關(guān)酶活力，可以一定程度上上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中MAPKs家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表達(dá)情況，使細(xì)胞處于激活狀態(tài)，以上結(jié)果說明DHA可以激活RAW264.7細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。本研究結(jié)果證實(shí)了DHA具有一定的體外免疫調(diào)節(jié)活性。

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