熱處理對(duì)噴砂、酸蝕及H2O2/HCl處理的鈦片表面MC3T3-E1細(xì)胞黏附、增殖及分化的影響研究

周建波，俞煥苗，周怡

純鈦及鈦合金由于其良好的生物相容性和卓越的機(jī)械性能而被廣泛應(yīng)用于牙種植體。但是，一般而言鈦金屬本質(zhì)上是生物惰性的，很難直接與周圍骨組織形成穩(wěn)定牢固的骨結(jié)合。于是，學(xué)者們想出各種方法（如機(jī)械打磨、噴砂、酸蝕及熱處理等）對(duì)種植體表面進(jìn)行改性，以期獲得良好的生物活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和種植體周圍骨組織的形成[1-3]，但最近有研究表明熱處理可能會(huì)改變種植體表面的結(jié)構(gòu)和性能，從而產(chǎn)生有利或不利的影響[4-5]。本研究擬將成骨細(xì)胞接種到不同的鈦片表面進(jìn)行培養(yǎng)，觀察成骨細(xì)胞早期黏附、增殖及分化的情況，以探討熱處理對(duì)該種植體表面活性的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料及試劑 商業(yè)純鈦片，直徑為10 mm或30 mm，厚2 mm（寧波廣慈醫(yī)療器械有限公司）；胎牛血清、-MEM培養(yǎng)基及胰酶（Gibco公司，美國(guó)）；曲拉通（TritonX-100，Sigma公司，美國(guó)）；多聚甲醛（Paraformaldehyde，ProSciTech公司，澳大利亞）；鬼筆環(huán)肽（Rhodamine phalloidin，Sigma公司，美國(guó)）；碘化丙啶（Propidiumiodide，Sigma公司，美國(guó)）；堿性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒（Wako公司，日本）；骨鈣素含量檢測(cè)試劑盒（Biomedicaltechnology公司，美國(guó)）。熒光正置相差顯微鏡（ECLIPSE-80I，Nikon公司，日本）；多光譜酶標(biāo)儀（產(chǎn)品型號(hào)：Spectra-Max Plus 384，廈門市寶能科技有限公司，中國(guó)）；圖像處理軟件（Image-proplus4，Media Cybernetics公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 鈦片表面處理及分組 鈦片表面先用320、500、800和1200目碳化硅水磨砂紙逐級(jí)打磨拋光，然后經(jīng)大顆粒金剛砂噴砂處理，壓力為4MPa；接著依次置于丙酮、75%乙醇、去離子水中各超聲清洗15min，50℃干燥后備用。將噴砂清洗后的鈦片用0.11mol/LHF和0.09mol/LHNO3混合液處理10 min，去離子水沖洗，50℃干燥；然后放于80℃的5.8 mol/L HC1和8.96 mol/L H2SO4混合液中浸泡30min，沖洗干燥；再接著用80℃的0.1 mol/L HCl和8.8 mol/L H2O2的混合液處理20min，沖洗干燥；最后，隨機(jī)選取一半經(jīng)過以上步驟處理的鈦片設(shè)為對(duì)照組（9片），剩下的一半鈦片經(jīng)400℃高溫處理1 h并自然冷卻，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組（9片）。所有的鈦片均分別用丙酮、75%乙醇、去離子水各超聲清洗15min，50℃干燥后即可進(jìn)行表面表征，而用于細(xì)胞培養(yǎng)的鈦片需在紫外線下正反面各照射1h。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將兩組鈦片分別放入24孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將傳至第3代的小鼠顱骨來源的成骨前體細(xì)胞（MC3T3-E1）接種到材料表面；接種密度：直徑為10mm的小鈦片1×104個(gè)細(xì)胞/片，直徑為30mm 的大鈦片1×105個(gè)細(xì)胞/片。加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液1ml或3ml，在37℃、95%濕度、5%CO2的孵箱中密閉培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基。

1.2.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 將分別培養(yǎng)了1、3和24h的小鈦片取出，先用37℃的PBS溶液輕輕漂洗，以去除未牢固粘附的細(xì)胞，接著用4%多聚甲醛溶液在4℃冰箱固定30min，繼續(xù)用PBS沖洗3遍；0.1%曲拉通滲透3 min，PBS沖洗3遍，牛血清白蛋白非特異性封閉3min；接下去用結(jié)合有FITC的鬼筆環(huán)肽（5 g/ml）在37℃避光的條件下處理50 min，PBS沖洗3遍；最后用50g/ml的碘化丙啶同樣在37℃避光的條件下5 min，PBS充分漂洗以去除殘余的染料。

經(jīng)過染色的鈦片馬上用熒光正置相差顯微鏡觀察并攝片。每片鈦片任選10個(gè)視野攝片，并隨機(jī)選擇30個(gè)細(xì)胞用于細(xì)胞形態(tài)因子分析[6]。所有圖片用專用軟件處理，其中細(xì)胞形態(tài)因子的計(jì)算公式為：=4 A/p2，A代表細(xì)胞伸展的面積，P表示細(xì)胞的直徑。當(dāng)形態(tài)因子為最大值1時(shí)代表一個(gè)完美的圓，而細(xì)線形狀物體的形態(tài)因子為最小，趨向于0。

1.2.2.2 成骨細(xì)胞的早期黏附和增值能力檢測(cè) 兩組鈦片分別于接種細(xì)胞后1h、3h、24 h、4 d和8 d取出，用PBS洗去未附著的細(xì)胞，同時(shí)將接種了細(xì)胞的鈦片轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中（減少附著在細(xì)胞培養(yǎng)板上而不是鈦片上的成骨細(xì)胞的干擾影響），每孔加入1 ml檸檬酸緩沖溶液，置于－80℃低溫冰箱中保存。等樣品收集完畢，用反復(fù)凍融法將所有的樣品連續(xù)凍融3次，收集細(xì)胞裂解液，離心，取上清液用于細(xì)胞DNA含量測(cè)定。本研究采用特定的試劑盒檢測(cè)總的細(xì)胞DNA含量來推測(cè)細(xì)胞數(shù)。根據(jù)廠家提供的檢測(cè)說明，20 l上清液置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再用80 l TE工作液稀釋，接著加入100 l picoGreen工作液，避光室溫孵育2～5 min，多光譜酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度（Ex485nm/Em510nm）。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品DNA的含量。

1.2.2.3 堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定成骨前體細(xì)胞在鈦片表面分別培養(yǎng)4、7和14 d，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，加特定細(xì)胞裂解液4℃作用15 min，收集后12 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液。所有樣本用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性。具體操作方法為：取20 l待測(cè)樣品與100 l工作液混合，37℃避光孵育15min，最后加80 l NaOH溶液終止反應(yīng)，405 nm讀取吸光度值求得ALP活性。同時(shí)用同樣的樣本經(jīng)稀釋后與BCA蛋白檢測(cè)工作液混合，37℃避光孵育30min，570 nm讀取吸光度值求得細(xì)胞總蛋白濃度。細(xì)胞內(nèi) ALP活性值均用相應(yīng)的細(xì)胞總蛋白濃度予以校準(zhǔn)，以獲得相對(duì)ALP活性值。

1.2.2.4 骨鈣素（OC）含量的測(cè)定 鈦片表面培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素主要是通過測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)基中的 OC含量來確定的。當(dāng)培養(yǎng)14d后，收集全部的細(xì)胞培養(yǎng)基并記錄其體積（ml），10 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液測(cè)量OC含量。通過特定的OC含量測(cè)定試劑盒，采用ELLISA法來測(cè)定，完全依據(jù)試劑商提供的操作步驟進(jìn)行。所測(cè)的骨鈣素含量乘以細(xì)胞培養(yǎng)基的量得到細(xì)胞分泌的OC總量，最后用細(xì)胞總蛋白濃度校準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈦片表面細(xì)胞形態(tài)的觀察結(jié)果 接種1h后，成骨細(xì)胞開始在鈦片表面粘附伸展，可以觀察到許多細(xì)小的細(xì)胞偽足（圖1），而對(duì)照組的鈦片表面（圖2）黏附了更多的細(xì)胞，并且細(xì)胞的鋪展面積明顯大于實(shí)驗(yàn)組；到3h時(shí)，對(duì)照組鈦片較實(shí)驗(yàn)組鈦片表面的細(xì)胞鋪展面積更大，可觀察到許多粗大的細(xì)胞偽足；而培養(yǎng)24 h后，兩組鈦片表面的細(xì)胞基本上完全伸展。

2.2 兩組細(xì)胞形態(tài)因子檢測(cè)結(jié)果比較隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的形態(tài)因子逐漸變小，兩組細(xì)胞形態(tài)因子在每一個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）。見表1。

2.3 兩組鈦片表面成骨細(xì)胞粘附及增殖能力檢測(cè)結(jié)果比較 兩組培養(yǎng)1h、4d及8 d鈦片表面粘附的成骨細(xì)胞差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05），而培養(yǎng)3及24 h時(shí)成骨細(xì)胞數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。見表2。

2.4 兩組堿性磷酸酶活性及骨鈣素含量比較 對(duì)照組表面生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)所表達(dá)的堿性磷酸酶活性均顯著高于實(shí)驗(yàn)組（均＜0.05）。見表3。誘導(dǎo)培養(yǎng) 2周后，對(duì)照組的骨鈣素含量為（149±11.3）ng/mg，實(shí)驗(yàn)組（116±8.9）ng/mg，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜ 0.05）。

3 討論

研究認(rèn)為較小的細(xì)胞形態(tài)因子往往意味著較好的細(xì)胞伸展情況[6-7]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組鈦片表面的細(xì)胞形態(tài)因子在各時(shí)間點(diǎn)均明顯小于實(shí)驗(yàn)組，這表明對(duì)照組鈦片更有利于成骨細(xì)胞的粘附和伸展。同時(shí)，成骨細(xì)胞黏附能力的檢測(cè)結(jié)果也表明對(duì)照組鈦片可能更有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤其是1 h時(shí)最明顯。國(guó)外有研究認(rèn)為，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞只有完全黏附伸展后才能開始功能表達(dá)[8]。所以，對(duì)照組鈦片可能有利于成骨細(xì)胞的功能表達(dá)。關(guān)于細(xì)胞增殖能力的比較，同樣是對(duì)

圖1 Mc3T3-E1細(xì)胞在鈦片表面培養(yǎng)1、3和24 h后的形態(tài)學(xué)變化；注：a：培養(yǎng)1 h，b：培養(yǎng)3 h，c：培養(yǎng)24 h

圖2 Mc3T3-E1細(xì)胞在鈦片表面培養(yǎng)1、3和24 h后的形態(tài)學(xué)變化；注：a：培養(yǎng)1 h，b：培養(yǎng)3 h，c：培養(yǎng)24 h

表1 兩組細(xì)胞形態(tài)因子檢測(cè)結(jié)果比較

表3 兩組堿性磷酸酶活性比較 nmol/g/hr

照組鈦片更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。堿性磷酸酶活性的檢測(cè)結(jié)果及骨鈣素含量的檢測(cè)結(jié)果均提示對(duì)照組鈦片更有利于成骨細(xì)胞的分化。上述結(jié)果似乎很難解釋，因?yàn)橐酝囊幌盗畜w內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)已明確證實(shí)H2O2/HCl酸蝕加400℃1 h處理后得到的種植體表面具有高度的生物活性，大大促進(jìn)了成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化，有利于種植體與骨組織的結(jié)合[1-3]。

根據(jù)Wang等[9-10]的研究，鈦金屬用H2O2/HCl溶液處理后會(huì)在表面形成無定形的氧化鈦凝膠層；當(dāng)繼續(xù)在400℃高溫下處理1 h，無定形的氧化鈦會(huì)轉(zhuǎn)變成有晶體結(jié)構(gòu)的銳鈦礦，并且這種銳鈦礦氧化層在模擬體液中24 h內(nèi)就能沉積出羥基磷灰石，顯示出很高的生物活性。然而本研究顯示，就是這種具有明顯生物活性的表面，與對(duì)照組鈦片相比卻處于劣勢(shì)。鈦金屬與過氧化氫溶液反應(yīng)時(shí)，金屬表面會(huì)帶有大量的鈦羥基（Ti-OH）[11]，而大量的Ti-OH是沉積羥基磷灰石（HA）必要的功能基團(tuán)。高溫處理會(huì)極大的破壞Ti-OH，所以實(shí)驗(yàn)組鈦片表面的Ti-OH數(shù)量會(huì)明顯的減少。也許這就是對(duì)照組鈦片更有利于HA的沉積而顯示出更高生物活性的原因。一旦鈦金屬與強(qiáng)酸處理，其表面就會(huì)有氫化鈦（TiH2）形成；而400℃的高溫能夠輕易的將TiH2從鈦表面除去[12]。當(dāng)然，目前關(guān)于 TiH2對(duì)種植體表面生物活性的影響報(bào)道并不多。有研究認(rèn)為，TiH2能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)種植體的早期骨整合[13]。可能的機(jī)制為：種植體表面的TiH2能夠逐漸釋放出氫離子（H+），而H+可能會(huì)與環(huán)境中的Ca2+交換，而Ca2+的沉積對(duì)于HA的形成是至關(guān)重要的；被釋放的H+可能會(huì)攻擊并打斷Ti-O鍵，從而形成Ti-OH，而Ti-OH的形成對(duì)HA的沉積是同樣重要的。

表2 兩組鈦片表面成骨細(xì)胞黏附及增殖能力檢測(cè)結(jié)果比較 萬個(gè)

雖然實(shí)驗(yàn)組的銳鈦礦晶體結(jié)構(gòu)有利于成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化，但是對(duì)照組鈦片表面的Ti-OH及TiH2結(jié)構(gòu)可能同樣有利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能表達(dá)。也許Ti-OH及TiH2結(jié)構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用超過了銳鈦礦結(jié)構(gòu)的促進(jìn)作用，這可能是對(duì)照組鈦片更有利于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的原因。當(dāng)然，本研究只是觀察到了種植體表面改性過程中的一種現(xiàn)象，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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