Streptomyces pristinaespiralis LS15產普那霉素的發酵培養基優化

李靖靖，李紅梅

（鄒平縣綜合檢驗檢測中心，山東鄒平 256200）

隨著臨床上抗生素的普遍應用，很多感染性病菌的耐藥性也逐漸增強，致使抗生素的劑量不斷加大，如耐青霉素的肺炎球菌、耐萬古霉素的腸球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌等[1-2]。因此迫切需要新型抗生素來抵抗這些耐藥菌株的感染，而普那霉素則成了新型抗生素的首選。普那霉素屬于鏈陽性菌素類抗生素，由始旋鏈霉菌發酵產生，可以通過與核糖體結合從而抑制蛋白的合成，對大多數革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有強烈的抑制作用，是萬古霉素的替代藥物[3]。更重要的是，對普那霉素制劑的臨床應用證明，只有極少數的細菌會對其產生微弱的耐藥性，因此普那霉素在抵抗多重耐藥菌方面起到了重要作用，具有廣闊市場前景[4]。

目前，國內對普那霉素的研究較少，菌株發酵產量尚處于較低的水平，一般效價不超過2 000 μ/mL，發酵單位不超過1 500 mg/L[3-4]。為了進一步提升普那霉素的發酵水平、降低生產成本，試驗對一株普那霉素產生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15進行了搖瓶發酵培養基的優化，并且取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

放線菌S.pristinaespiralis LS15，土壤中篩選并由實驗室保藏。

瓊脂培養基：淀粉15 g/L，黃豆粕3 g/L，可溶性酵母粉1 g/L，瓊脂18 g/L，初始pH值7.0。于121℃條件下滅菌20 min。

種子培養基：可溶性酵母粉6 g/L，葡萄糖30 g/L，KH2PO4·2H2O 1.2 g/L，（NH4）2SO45 g/L，K2HPO4·2H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，ZnSO4·7H2O 0.03 g/L，pH 值 7.0。于115℃條件下滅菌20 min。

發酵培養基：同種子培養基。

1.2 培養方法

種子液培養：從瓊脂培養基上刮取孢子兩環，在無菌條件下接入50 mL/250 mL的種子培養基中，于30℃，200 r/min條件下搖床培養30 h。

發酵培養：吸取種子液4 mL，無菌條件下接入50 mL/250 mL的發酵培養基中，于30℃，200 r/min條件下搖床培養72 h。

1.3 PB-CCD優化培養基

發酵培養基中有8種成分，其中FeSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O這2種成分屬于微量元素，添加量較小，因而暫時不作為優化的對象，其余6種培養基組分的添加量較大，在此作為重點優化對象。PB-CCD的設計及結果分析采用軟件Design-Expert 8.0。

1.4 發酵液中普那霉素含量測定

高效液相色譜法測定發酵液中普那霉素含量[3]。

1.5 酶活測定

己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）、天冬氨酸激酶 （Aspartokinase，AK）、檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS） 的酶活測定參照相關文獻[5-8]。

2 結果與分析

S.pristinaespiralis LS15目前發酵培養基的組成有8種物質，如前所述，鋅和鐵2種金屬離子對于微生物的生理代謝及酶的催化具有重要作用，嚴格來講不屬于營養成分，而且其濃度在一定范圍內對普那霉素的產量影響不大，所以暫時沒有對其進行優化。試驗采用PB-CCD的響應面方法對菌株S.pristinaespiralis LS15發酵培養基的6種主要營養成分進行了優化研究，并取得了較好的效果。

2.1 PB試驗篩選主要因素

Plackett-Burman（PB） 試驗是一種近飽和二水平試驗設計方法，能夠在眾多因素中快速地評選出哪些因素對于目標具有顯著的影響[9-10]。采用Design-Expert 7.0軟件，分別對培養基中的優化成分選擇了較高水平（以+1表示） 和較低水平（以-1表示）。

PB試驗的分組設計見表1。

表1 PB試驗的分組設計

PB試驗根據所設計的高低水平可以自動生成一組試驗方案，共12組。按照該方案配制發酵培養基對S.pristinaespiralis LS15進行不同組別的發酵試驗，每組3個平行，發酵結束后測定普那霉素產量并利用Design-Expert 7.0軟件進行數據分析。如表2所示，p值是表征模型及因素顯著與否的重要參數，如果p＜0.05，那就表明該因素具有顯著影響。從表3中看出，首先該模型的p=0.018 4，說明該PB試驗的設計是合理的，效果非常顯著。p＜0.05的因素有3個，分別是K2HPO4、酵母抽提物和MgSO4，說明這3種成分影響普那霉素搖瓶產量程度較大，而葡萄糖、硫酸銨和磷酸二氫鉀這3種成分影響較小。表2中的系數代表了該因素的增量與普那霉素產量的關系，例如，酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4這3個因素的系數為正值，表示增加三者的濃度可以進一步提高普那霉素的產量，而增加其他3個因素的濃度會降低普那霉素的合成。但是，由于葡萄糖等3種成分的p＞0.05，影響不顯著，所以在后續的試驗設計中，只考慮酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4三者即可。

PB模型的顯著性分析見表2。

表2 PB模型的顯著性分析

2.2 梯度爬坡試驗

根據表2中的系數和p值分析，對于普那霉素產量影響較小的3個因素不再做進一步優化，其濃度仍然為葡萄糖 50 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2SO45 g/L，而對影響顯著的酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4這3種營養物質做后續的爬坡試驗，以合適的步長最快地逼近最高適響應區域。從表4顯示的結果可以看出，隨著正系數影響因素質量濃度的增加，普那霉素的產量也隨之增加，與PB試驗模型的預測相吻合，在第4組試驗中達到最高值為1.92 g/L。該組別的營養成分質量濃度不一定就是最優值，但可以肯定普那霉素的產量最高點就在組別4附近，因為各種營養成分間還存在著交互作用，因此將第4組中的可溶性酵母粉、磷酸氫二鉀和硫酸鎂作為后續試驗的中心點。

梯度爬坡試驗見表3。

表3 梯度爬坡試驗/g·L-1

2.3 中心組合試驗

在中心組合試驗中，將酵母抽提物質量濃度設定為7～9 g/L，K2HPO4質量濃度設定2～3 g/L，MgSO4質量濃度設定1～2 g/L，Design-Expert 7.0軟件會自動生成 5 個水平 （-1.682，-1.000，0，1.000，1.682）的試驗考查。

中心組合試驗設計及結果見表4。

表4 中心組合試驗設計及結果

從表4可以看出，該模型的p＜0.000 1，失擬合度不顯著，表明模型可信度較高。而且，根據普那霉素的實際搖瓶產量與模型預測值相比較，兩者數據差別不大，說明該模型的準確度較高。

Design-Expert軟件同時可以生成3種因素的響應面圖及其等高線圖，該圖能夠反映出各種組分的相互影響[11-12]。

酵母抽提物和磷酸氫二鉀對普那霉素搖瓶產量的影響見圖1，酵母抽提物和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產量的影響見圖2，磷酸氫二鉀和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產量的影響見圖3。

從圖1、圖2、圖3可以看出，營養成分間存在兩兩的交互作用，任何一種成分的過高或者過低都會使普那霉素的產量下降。

圖1 酵母抽提物和磷酸氫二鉀對普那霉素搖瓶產量的影響

圖2 酵母抽提物和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產量的影響

Design-Expert 8.0軟件擬合得到了普那霉素搖瓶產量的二次多項式方程為：

其中b，e，f分別為酵母抽提物、磷酸氫二鉀和硫酸鎂的質量濃度。對該回歸方程的3個自變量求導即可得到模型的極值點，軟件的數據分析顯示，當酵母抽提物質量濃度7.52 g/L，磷酸氫二鉀質量濃度2.26 g/L，硫酸鎂質量濃度1.81 g/L時，普那霉素產量最高為2.25 g/L。

圖3 磷酸氫二鉀和硫酸鎂對普那霉素搖瓶產量的影響

根據PB-CCD的培養基優化試驗，得到的優化培養基為：酵母抽提物7.5 g/L，葡萄糖50 g/L，KH2PO·42H2O 1.2 g/L，（NH）42SO48 g/L，K2HPO·42H2O 2.5 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，ZnSO·47H2O 0.05 g/L。以上述配比進行普那霉素的搖瓶發酵，實際質量濃度分別為2.33，2.25，2.28 g/L，基本符合模型的預測值，比起初始培養基的1.18 g/L提高了86.4%，證明了PB-CCD培養基優化方法的有效性。

2.4 不同培養基中的胞內酶活測定

為了初步說明S.pristinaespiralis LS15在優化培養基中能夠高產普那霉素，試驗選取了菌株代謝途徑中的一些關鍵酶進行了酶活測定，這些酶包括糖酵解途徑（EMP途徑） 中的己糖激酶（hexokinase，HK） 和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK），二氨基庚二酸途徑（DAP途徑） 中的天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）和三羧酸循環過程中（TCA） 的檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）。S.pristinaespiralis LS15 分別在初始培養基和優化培養基中發酵，相同時間相同處理方式下測定4種酶的活力。

菌株S.pristinaespiralis LS15在2種培養基中的酶活比較見表5。

普那霉素的分子骨架由很多氨基酸殘基聚合而成[2]，因此菌體細胞中氨基酸的合成對于普那霉素的產量有重要的影響，而氨基酸的合成主要來自TCA循環。從表5的酶活比較中可以看出，CS作為TCA循環中的第1個關鍵酶，其酶活在優化培養基中提高了68.7%，說明TCA循環在優化培養基中得到了強化。賴氨酸主要由DAP途徑合成，而DAP途徑中的關鍵酶AK在優化培養基中的活性提高了近1倍。TCA循環的增強勢必需要上游EMP途徑的增強，通過酶活比較可知，EMP途徑中的HK與PK也確實有不同程度的酶活提升。

表5 菌株S.pristinaespiralis LS15在2種培養基中的酶活比較

3 結論

發酵是一個非常復雜的生化反應過程，影響其好壞有諸多因素，其中營養成分是一個非常重要的因素，是進行發酵調控及過程優化的基礎，并且需要針對不同的普那霉素生產菌或者突變株開發出適合其生長及合成產物的培養基。國內學者對普那霉素的研究較少，何云飛等人[13]對一株普那霉素產生菌S.pristinaespiralis 9-10的培養基優化發現，適合其發酵的碳源為葡萄糖或淀粉，有機氮源為魚粉，且二者濃度對普那霉素產量均有較大影響；對S.pristinaespiralis ZP-7[14]的研究發現，培養基中添加1.5 g/L的正丙醇有利于提升普那霉素的發酵產量；錢思宇等人[15]以S.pristinaespiralis RP59500為研究對象，發現最適碳源和氮源分別為蔗糖、酵母粉，且補加氨基酸可以有效提升普那霉素的發酵產量。試驗確定對S.pristinaespiralis LS15發酵具有顯著影響作用的因素為酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4，最終搖瓶產量為2.23 g/L，該發酵水平仍然不能滿足工業化生產需求，后續研究工作需要聚焦于發酵工藝方面進行優化及調控，進一步提升普那霉素的發酵水平。

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