清腦片對沙鼠腦缺血再灌注模型血漿ET和CGRP含量及腦組織病理變化的影響＊

高延玲，郝少君，謝國旗，王紅宇，陳維亮，孔學軍，張正臣

腦血管疾病是一種嚴重危害人類生命健康，影響正常生活的常見病。在我國的疾病死因中一直居于首位，其中缺血性腦卒中約占75%～90%［1］。腦卒中（stroke），中醫稱為中風，具有高發病率、高死亡率和高致殘率的特點，是當前嚴重威脅人類健康與生命的主要疾病。中風屬于急性腦血管病，可分為出血性腦血管病和缺血性腦血管病。由于缺血性腦卒中的發病率遠高于出血性腦卒中，因此，研究和防治缺血性腦卒中，減少死亡率和致殘率，已成為當前醫學的攻關重點［2］。用于研究腦缺血的動物模型中，沙鼠以其獨特腦部構造逐漸成為國內外用于篩選腦保護活性成分或腦保護藥物的新興、主流模型［3］。該文主要觀察清腦片對沙鼠腦缺血模型血漿內皮素（endothelin，ET），降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）含量以及對腦組織海馬區和皮質區病理變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 長爪沙鼠，雄性，50～70 g，級別：清潔級，合格證號：1605160013，提供單位：浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2014-0001。 實驗室合格證：SYXK（豫）2015-0005。

1.2 藥物試劑 清腦片（白芷、當歸、川芎、勾藤、細辛、龍骨、薄荷；功能主治：活血、行氣通竅、鎮痛、清利頭目。用于頭痛、頭暈、腦震蕩后遺癥；用法用量：口服，3次/d，3～5片/次），中國人民解放軍第三七一中心醫院提供。制法：取白芷50 g、當歸75 g、川芎75 g粉碎成100目細粉備用。剩余白芷、當歸、川芎及其余各味藥材粉碎成10目粗粉，加8倍水煎煮兩次，首次2 h，二次2 h，合并煎煮液，濾過。濾液濃縮至相對密度1.15～1.30（80℃）。加入上述細粉、淀粉適量，混勻，干燥成干膏，粉碎，用稀糖漿經14～16目篩制粒，50～60℃烘干，用14目篩整粒，加入1%硬脂酸鎂混勻，壓片（每片0.3 g），包衣，制成1000片即得。中國人民解放軍第三七一中心醫院提供，生產批號：20141125。

腦絡通膠囊，生產廠家：河南輔仁堂制藥有限公司；批號：150309。

水合氯醛，鄭州派尼化學試劑廠，批號：20150427。

生理鹽水，河南雙鶴華利藥業有限公司生產，批號：13090906B。

Rat ET檢測試劑盒，生產廠家：北京誠林生物技術有限公司，批號：E20160501A；CGRP ELISA檢測試劑盒，生產廠家：北京誠林生物技術有限公司，批號：E20160501A。

1.3 實驗儀器 JM 1000電子秤，余姚記銘稱重校驗設備有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JZ19600型手動移液器，美國賽默飛世爾科技有限公司；HHS-21-8型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BCD-248T型冰箱，新飛電器有限公司；紫外/可見分光光度計，型號：UV1000，上海天美科學儀器有限公司；漩渦混合器，型號：TYXH-1，無錫沃信儀器有限公司；細胞成像微孔板檢測儀，型號：CYT3 MFVDG，美國伯騰儀器有限公司。

1.4方 法

1.4.1 造模方法 取體重為50～70 g健康雄性長爪沙鼠60只，隨機分為6組，每組10只，分別為假手術組、模型組、腦絡通膠囊組及高、中、低劑量清腦片組。正常飼養3 d，開始灌服相應的藥物，腦絡通膠囊灌服劑量為0.5 g/kg（相當于臨床劑量的10倍），高、中、低劑量清腦片組給藥劑量分別為1.5 g/kg、0.75 g/kg、0.375 g/kg（相當于臨床劑量的20倍、10倍、5倍），假手術組、模型組分別灌服同體積的生理鹽水，各組的灌胃體積為1 ml/100 g。給藥1次/d，連續給藥10 d。于第9天晚上禁食12 h后，最后一次灌胃1 h后，用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉沙鼠，待沙鼠進入昏迷狀態時，對其進行先結扎雙側頸總動脈10 min，然后再灌注時間為60 min［4］。其中假手術對照組做假手術處理，即只暴露雙側頸總動脈外，其他操作同造模各組。等再灌注時間結束后可迅速用一次性使用靜脈采血針直接插入頸總動脈另一側接入用抗凝管取2 ml左右血液，室溫放置約30 min后，4000 r/min離心15 min，取血后立即斷頭在冰盤中剝離全腦，把腦從矢狀線分開成對稱的腦，取出海馬區，迅速置于10%甲醛溶液中浸泡固定。

1.4.2 檢測指標 （1）動脈取血，肝素抗凝后4000 r/min離心15 min取血漿，測血漿中ET，CGRP含量。（2）腦組織切片的形態學評估：用4%緩沖甲醛溶液固定腦組織切片；石蠟包埋腦組織并切成4 μm厚的切片；切片用HE染色并評估腦組織形態學改變。

2 結果

2.1 清腦片對沙鼠腦缺血模型血漿中ET、CGRP含量的影響 與假手術組相比，模型組可顯著升高血漿中ET含量 （P＜0.01），顯著降低血漿中CGRP水平（P＜0.01），提示沙鼠腦缺血再灌注模型造模成功。與模型組相比，高、中劑量清腦片組和腦絡通膠囊組可顯著降低血漿中ET含量（P＜0.01）；高劑量清腦片組和腦絡通膠囊組可顯著升高血漿中CGRP含量（P＜0.01），中、低劑量清腦片組可明顯升高血漿中 CGRP 含量（P＜0.05）。 見表 1。

表1 清腦片對沙鼠腦缺血模型血漿中ET、CGRP含量的影響（x±s）

2.2 清腦片對沙鼠腦缺血模型腦組織海馬區的病理變化 對腦缺血再灌注模型沙鼠腦組織海馬區組織病理觀察如下（圖1～6）：假手術組：沙鼠海馬區組織結構完整，神經元密集、排列規則，胞質豐富，核仁明顯；模型組：海馬區神經元細胞稀疏，排列不規則，大部分細胞胞漿淡染，胞核皺縮，梗死面積較大；腦絡通膠囊組：大部分海馬區神經元細胞排列規則，少數神經元壞死；清腦片用藥組：大部分海馬區神經元細胞排列規則，少數神經元壞死，海馬區結構清晰基本正常，梗死面積減少，具體病理分級見表2。

圖1 假手術組海馬區（HE×400）

圖2 模型組海馬區（HE×400）

圖3 腦絡通膠囊組海馬區（HE×400）

圖4 高劑量清腦片組海馬區（HE×400）

圖5 中劑量清腦片組海馬區（HE×400）

圖6 低劑量清腦片組海馬區（HE×400）

表2 清腦片對沙鼠腦缺血模型腦組織海馬區病理改變的影響

經Ridit檢驗，與假手術組相比，模型組腦組織海馬區出現了顯著的病理學變化（P＜0.01），說明腦缺血再灌注模型造模成功。與模型組相比，高劑量清腦片組及腦絡通膠囊組可顯著改善沙鼠腦組織海馬區病理損傷（P＜0.01），中、低劑量清腦片組可明顯改善沙鼠腦組織海馬區病理損傷（P＜0.05）。

2.3 清腦片對沙鼠腦缺血模型腦組織皮質區的病理變化 對沙鼠腦缺血模型腦組織皮質區組織病理觀察如下（圖7～12）：假手術組大腦皮質無水腫，神經元密集、排列規則，胞質豐富，無明顯水腫；模型組大部分神經元壞死，神經元細胞溶解消失或見少量固縮核殘留；腦絡通膠囊組大腦皮質區梗死范圍縮小，少數神經元壞死，神經元較密集，胞質較豐富，皮質區呈點狀梗死；清腦片用藥組大腦皮質區較缺血組再灌注組梗死范圍縮小，神經元細胞溶解和固縮數量顯著減少，水腫程度顯著減輕，具體病理分級參見表3。

圖7 假手術組皮質區（HE×400）

圖8 模型組皮質區（HE×400）

圖9 腦絡通膠囊組皮質區（HE×400）

圖10 高劑量清腦片組皮質區（HE×400）

圖11 中劑量清腦片組皮質區（HE×400）

圖12 低劑量清腦片組皮質區（HE×400）

表3 清腦片對沙鼠腦缺血模型腦組織皮質區病理改變的影響

經Ridit檢驗，與假手術組相比，模型組腦組織皮質區出現了顯著的病理學變化（P＜0.01），說明復制腦缺血再灌注模型成功。與模型組相比，高劑量清腦片組及腦絡通膠囊組可顯著改善沙鼠腦組織皮質區病理損傷（P＜0.01），中、低劑量清腦片組可明顯改善沙鼠腦組織皮質區病理損傷（P＜0.05）。

3 討論

腦卒中屬于常見的急性多發病，與惡性腫瘤、心臟病構成三類嚴重威脅人類生命的重大疾病［5］。我國屬于腦卒中的高發地區，據流行病學統計，我國每年患腦卒中約600萬人，死亡近100萬人，在幸存者中約3/4的患者留下偏癱等后遺癥狀，部分患者喪失勞動能力和生活能力［6］。中醫學認為，腦缺血屬于“缺血中風”的范圍，血瘀是缺血性中風的常見原因［7］。現代醫學認為腦缺血的病因和發病機制傾向于微血栓和血流動力學、血液流變性障礙。這與中醫的“血瘀”觀是一致的，血瘀是腦缺血的病理基礎，血瘀導致了血栓形成［8］。

用于研究腦缺血的動物模型較多，其中沙鼠因大腦基底動脈環先天性發育不完全而成為腦缺血研究的較理想模型，沙鼠腦缺血模型在研究單側腦缺血和全腦缺血方面都具有獨特的優勢，在研究腦缺血后腦區的病理變化、再灌注損傷機制及開發腦保護藥方面都得到十分廣泛的應用［9］。該實驗選用血漿中ET、CGRP含量作為指標。ET是目前最強的內源性血管收縮因子，局部缺血的腦組織在缺血期，ET的基因表達呈顯著的進行性增強，ET增高可增加腦組織內水、鈣含量，加重腦組織缺血及神經元損傷［10，11］。 CGRP 在體內主要分布于神經系統、心血管系統和肺組織，在血管系統，幾乎所有的血管床均有CGRP的神經纖維分布，CGRP是體內已知最強的舒血管物質，是ET的內源性拮抗劑，CGRP能有效地防治組織的缺血－再灌注損傷［12］。

腦缺血再灌注損傷主要是指由于腦缺血導致的腦細胞損傷，而恢復血液再灌注后，其缺血性損傷反而會進一步加重。腦組織血流供應中斷后引起的一系列缺血級聯反應以及再灌注損傷，會影響腦缺血患者結局的重要環節，也是臨床治療的難點。與其他器官相比，腦每時每刻需要充足的含氧血為其供應能量。動物實驗發現，血管沒發生收縮時就會出現意識障礙，腦血流完全停止即可產生不可逆損傷。缺少血液供應的腦組織可發生缺血性壞死或梗死，當缺血情況嚴重或持續時間較長時，也會產生局灶性或彌散性缺血改變，并進一步損害神經功能。該實驗選擇腦絡通作為陽性對照藥，因腦絡通膠囊為處方類心腦血管類藥，具有擴張血管、增加腦血流量作用，臨床用于腦血栓、腦動脈硬化、中風后遺癥等各種腦血管疾病氣虛血瘀證引起的頭痛、眩暈、半身不遂、肢體發麻、神疲乏力等癥，且臨床效果明顯，作用顯著。

該實驗研究表明，高、中、低劑量清腦片組可顯著降低血漿中ET含量，升高血漿中CGRP含量，可顯著改善沙鼠腦組織、海馬區皮質區病理損傷。提示ET和CGRP參與腦缺血、腦水腫的病理生理過程。口服清腦片能顯著降低急性腦缺血后沙鼠血漿中ET的含量，升高CGRP的含量，改善腦血流，減少腦組織內水、鈣含量，減輕腦組織缺血及神經元損傷，從而達到醒神通絡、溫經祛瘀的作用，可能是治療急性腦缺血再灌注的重要機理之一。

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