復方紫草油微生物限度檢查法的建立＊

高 媛，劉云云，馬曉昱，張世曉，陳 瑤

復方紫草油是《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》［1］收載的品種，由紫草，金銀花，白芷等藥材加入麻油浸漬，熱提而成，具有清熱解毒，涼血鎮(zhèn)痛的功效。用于燒傷、燙傷、創(chuàng)傷潰瘍及濕疹等癥。本品為非無菌制劑，根據(jù)質量標準要求，進行微生物限度檢查，《中國藥典》2015 年版四部［2，3］較 2010 年版在微生物限度檢查方法上有非常顯著改變。本文對復方紫草油進行微生物限度檢查的方法適用性試驗，結果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HK-DC-1200B電子天平（福州華科電子儀器有限公司）；YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；11211 BBC86生物安全柜（山東博科生物產業(yè)有限公司）；MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱 （上海博迅實業(yè)有限公司）；XJX-150液晶細菌培養(yǎng)箱 （常州市科邁實驗儀器有限公司）

1.2 培養(yǎng)基和稀釋液 胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基（批號：20160120）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （批號：20160102）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 （批號：20160225）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 （批號：20170322）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下稱稀釋液，批號：20170308），上述培養(yǎng)基均來自北京奧博星生物科技有限責任公司；聚山梨酯80（批號：F20111213）、司盤 80（批號：F20030927）、單硬脂酸甘油酯（批號：20130412）、十四烷酸異丙酯（批號：20151125），上述試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司。培養(yǎng)基的適用性檢查符合相應的《中國藥典》2015年版四部通則的規(guī)定。

1.3 試驗菌種 金黃色葡萄球菌 ［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63 501］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、銅綠假單胞菌［CCMC（B）10 104］均購于山東省藥檢所；黑曲霉 ［CMCC（F）98 003］為軍委后勤保障部衛(wèi)生局藥檢所提供；用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

1.4 樣品 復方紫草油（解放軍第159醫(yī)院，批號：151111、151210、151227）。

1.5 方 法

1.5.1 菌液的制備［2］按照《中國藥典》2015年版四部要求，接種金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)18 h；接種枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)48 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)不大于1000 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，23℃培養(yǎng)120 h。用5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子制成孢子懸液，再用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)不大于1000 cfu的孢子懸液。

1.5.2 供試液的制備 取供試品7組，每組各10ml，分別加入：A組：無菌十四烷酸異丙酯5 ml；B組：無菌十四烷酸異丙酯10 ml；C組：無菌十四烷酸異丙酯15 ml；D組：無菌十四烷酸異丙酯20 ml；E組；無菌聚山梨酯80 10 g；F組：十四烷酸異丙酯10 ml和聚山梨酯80 5 g無菌混合物；G組；司盤80 5 g、單硬脂酸甘油酯3 g和聚山梨酯80 10 g無菌混合物；7組分別混勻，再加入稀釋液至100 ml，混勻，靜置。

1.5.3 回收率測定

1.5.3.1 試驗組 取1∶10供試液G組9.9 ml和0.1 ml的試驗菌液，混勻，取1 ml注入平皿中。

1.5.3.2 供試品對照組 取1∶10供試液G組9.9 ml和0.1 ml的稀釋液，混勻，取1 ml注入平皿中。

1.5.3.3 菌液組 取相應稀釋劑替代供試液，加入各試驗菌，使最終菌濃度＜100 cfu/ml。

完成上述步驟，各組平皿分別傾注20 ml培養(yǎng)基搖勻，待凝固后，置藥典規(guī)定的條件下培養(yǎng)，計算菌落數(shù)，每種試驗菌平行制備2個平皿。

1.5.3.4 回收率的計算 ［（試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)］×100%，比值應在0.5～2。

1.5.4 控制菌檢查方法適用性試驗

1.5.4.1 試驗組 取1∶10的供試液G組10 ml和金黃色葡萄球菌或銅綠假單孢菌菌液1 ml（含菌量不大于100 cfu），接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

1.5.4.2 陽性對照組 取金黃色葡萄球菌或銅綠假單孢菌菌液1 ml（含菌量不大于100 cfu），接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

1.5.4.3 陰性對照組 取無供試品的G組供試液10 ml，接種至200 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

以上各組在33℃培養(yǎng)24 h，分別取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板或溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃培養(yǎng)72 h。

2 結果

2.1 不同供試液制備方法分析 不同方法制備的復方紫草油供試液呈現(xiàn)不同性狀，結果顯示：A組、B組、C組和D組的供試液溶液分層，上層紅色油狀液，下層水層；E組供試液溶液分層，上、下層均為淡粉色乳狀液；F組供試液溶液分層，上層為淡粉色乳狀液，下層為紅色油狀液；G組供試液溶液為穩(wěn)定淡粉色乳狀液。

表明以司盤80、單硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80作為中和劑，可以得到均一穩(wěn)定的供試液。

2.2 復方紫草油對試驗菌株的菌落回收試驗結果

試驗研究表明，使用混合中和劑配制的復方紫草油供試液試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值在0.5-2范圍內，結果見表1。

2.3 控制菌檢查方法適用性 控制菌檢查方法適用性試驗結果見表2。

表1 復方紫草油供試液對試驗菌株菌落回收試驗結果

表2 復方紫草油控制菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

《中國藥典》2015年版四部［2］微生物限度檢查較《中國藥典》2010年版一部［3］有顯著改變。制備穩(wěn)定的供試液是試驗順利開展的前提條件，油劑作為一種非水溶性的液體制劑，制備性狀穩(wěn)定的油劑供試品中和劑的使用是不可避免的。《中國藥典》2010年版一部收載制備油劑供試品可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻；《中國藥典》2015年版四部收載制備油脂類供試品，可加入無菌十四烷酸異丙酯［4］，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑。該文按照上述方法制備紫草油供試品，發(fā)現(xiàn)無論是單用聚山梨酯80，還是十四烷酸異丙酯都無法得到均一穩(wěn)定的復方紫草油供試品，導致取樣不均勻；進而使用兩種混合的中和劑，聚山梨酯80加十四烷酸異丙酯，雖然穩(wěn)定程度有所改善，但仍出現(xiàn)分層現(xiàn)象。為制備穩(wěn)定的復方紫草油供試品，本研究采用 《中國藥典》2010年版一部需用特殊方法制備供試液的供試品，中和劑選用5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯和10 g聚山梨酯80無菌混合物，發(fā)現(xiàn)該混合物可以較好地乳化復方紫草油，得到穩(wěn)定的乳狀液。以此，首先解決了制備穩(wěn)定均一供試液的方法。

《中國藥典》2015年版四部在計數(shù)方法的適用性試驗中，為了更有效地提高檢出率，對試驗組的制備進行了改進［5-7］，將供試液與試驗菌先混勻再注入平皿，且要求所加菌液的體積不超過供試液體積的1%，所以需將菌液稀釋至少于1000 cfu/ml，取1∶10 供試液 9.9 ml和 0.1 ml（＜1000 cfu）的試驗菌進行試驗。該文發(fā)現(xiàn)復方紫草油無抑菌作用，控制菌檢查可采用常規(guī)法。

［1］中央軍委后勤保障部衛(wèi)生局.《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》2015 年版第一冊［S］. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2016：61-62.

［2］國家藥典委員會編.《中國藥典》2015年版四部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：140-151.

［3］國家藥典委員會編.《中國藥典》2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-88.

［4］江志杰，張光華，牛振東.十四烷酸異丙酯在疏水性化妝品微生物檢驗中的應用［J］. 日用化學工業(yè)，2012，42（4）：274-276.

［5］鄭小玲，王征南，李 鈺.瑞他莫林軟膏的微生物限度檢查適用性試驗［J］. 中國現(xiàn)代應用藥學，2016，33（5）：634-637.

［6］劉 戈，邱唯佳，費夷敏.替硝唑栓微生物限度檢查方法適用性試驗研究［J］. 上海醫(yī)藥，2016，37（13）：73-76.

［7］蘇靜芬.賽霉安乳膏微生物限度檢查方法適用性檢查［J］.海峽藥學，2016，28（8）：81-83.