反相高效液相色譜法測定治糜康栓中苦參堿和氧化苦參堿的含量

于 澎，宋鳳媛，錢 圳，董坤園，許天陽

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

治糜康栓由黃柏、苦參、枯礬、兒茶、冰片5味中藥組成[1]，其中苦參為豆科植物苦參（Sophora fl avescens Ait.）的干燥根，主要活性成分為苦參堿及氧化苦參堿。

治糜康栓原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對黃柏中鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測定，但未說明苦參中活性成分的含量測定方法[2-3]。本文建立治糜康栓中苦參堿及氧化苦參堿總含量的測定方法，可以提升該制劑原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

LC-2030高效液相色譜儀（日本島津公司）、十萬分之一天平（METTLER TOLEDO）；色譜柱4.6 mm×250 mm，ZORBAX SB-C18，5 μm（Agilent Technoligies）；治糜康栓為市售品及自制品，苦參堿對照品（110805-200508）、氧化苦參堿對照品（110780-201508）由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 治糜康栓的制備 1）市售栓劑：購自通化金馬藥業(yè)，批號20170530，保存?zhèn)溆谩?）實(shí)驗(yàn)室自制治糜康栓：改進(jìn)藥典工藝路線，去掉醇沉步驟，其余步驟相同。2.2 苦參堿、氧化苦參堿的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（7 :93，每1.7 g磷酸二氫鉀加500 mL純水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH = 3）；檢測波長：220 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；2種成分理論板數(shù)均不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品適量，加流動(dòng)相分別制成約0.2 mg/mL的苦參堿溶液及約0.1 mg/mL的氧化苦參堿溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取上述2種栓劑，剪碎，每個(gè)樣品約取3 g，置具塞錐形瓶中，加0.5 mL濃氨水，潤濕后加20 mL三氯甲烷，稱重，超聲（功率250 W，頻率50 Hz）25 min，放至室溫，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，取上清液并過濾。取5 mL續(xù)濾液，以中性氧化鋁柱為固定相（100～200目，5 g，內(nèi)徑為1 cm），依次用三氯甲烷20 mL、三氯甲烷-甲醇（7 : 3）20 mL洗脫，收集洗脫液并蒸干。用流動(dòng)相溶解殘?jiān)ㄈ葜?0 mL，搖勻，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 測定方法 取上述對照品以及供試品溶液各l0 μL，依次注入高效液相色譜儀，測定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 1）苦參堿線性關(guān)系：配制濃度為20、50、100、150、200 μg/mL 的苦參堿對照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，得到苦參堿線性回歸方程：Y=5 456.8X+5 992.5，r2=0.999 9；結(jié)果表明在20～200 μg/mL范圍內(nèi)呈線性。2）氧化苦參堿線性關(guān)系：配制濃度為10、25、50、75、100 μg/mL的氧化苦參堿對照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，得到氧化苦參堿線性回歸方程：Y=5 429.7X-1 164.6，r2=0.999 8；結(jié)果表明在10～100 μg/mL范圍內(nèi)呈線性。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液，分別重復(fù)測定6次，10 μL/次。得到苦參堿與氧化苦參堿含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.04%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取實(shí)驗(yàn)室自制栓劑6份，按2.2.3項(xiàng)下制備方法制備，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，得出6份供試品中苦參堿及氧化苦參堿的總含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.84%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取實(shí)驗(yàn)室自制栓劑，按2.2.3項(xiàng)下制備方法制備，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、8、12、24 h后分析測定，得出苦參堿及氧化苦參堿總含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.63%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的實(shí)驗(yàn)室自制栓劑6份，每份約3.0 g，分別精密加入對照品適量，按2.2.3項(xiàng)下制備方法制備，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，得出實(shí)驗(yàn)室自制栓劑中苦參堿和氧化苦參堿的回收率分別為98.75%、99.46%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.61%、2.29%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 含量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液，按

2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測定，測定結(jié)果，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室自制栓劑及市售栓劑含量測定結(jié)果

3 小結(jié)

3.1 色譜柱的選擇 高效液相色譜法測定生物堿類成分，《中國藥典》分別收載了十八烷基硅烷鍵合硅膠柱和氨基柱測定法，但氨基柱價(jià)格較高不常用。同時(shí)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明其出峰時(shí)間過長，因此本試驗(yàn)選擇了實(shí)驗(yàn)室常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，同時(shí)測定治糜康栓中苦參堿及氧化苦參堿的總含量[4]。

3.2 檢測波長的選擇 本試驗(yàn)先后以205、210、215、220 nm為檢測波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波長越小，生物堿的吸收峰越大，但雜質(zhì)峰也隨之明顯，故本試驗(yàn)采用220 nm為測定波長。

3.3 供試品制備方法的選擇 分別以二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚作為提取溶劑，篩選后發(fā)現(xiàn)使用三氯甲烷并超聲處理，提取效率最高[5-7]。濃縮方式分別采用蒸干、常溫?fù)]干2種，結(jié)果表明，干燥方法對含量無顯著影響。為避免基線干擾，最終選擇以流動(dòng)相定容供試品。

3.4 流動(dòng)相的選擇 本次試驗(yàn)分別嘗試了以甲醇-水（55 : 45）、甲醇-水-三乙胺（55 : 45 : 0.02）[8]、乙腈-水-三乙胺（20 : 80 : 0.02）、乙腈-磷酸鹽（10 : 90）作為流動(dòng)相；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（7 : 93，1.7 g磷酸二氫鉀加500 mL純水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH = 3）時(shí)，峰形較好，平衡時(shí)間最短，可以排除來自其他成分的干擾，目標(biāo)組分可與樣品中其他組分較好的分離[9-11]。

3.5 栓劑前處理工藝的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)證明醇沉可能造成中藥有效成分的流失，影響中藥制劑的有效性，并且存在醇沉?xí)r間長等問題。本實(shí)驗(yàn)證明未經(jīng)醇沉的栓劑中苦參堿和氧化苦參堿的總含量顯著增多，可見除非實(shí)踐證明醇沉法不影響有效成分含量和療效，否則一般不宜采取醇沉法，以傳承中醫(yī)藥傳統(tǒng)特色[12]。

結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)將苦參堿或氧化苦參堿含量作為含量測定指標(biāo)是不完整的，以它們的總量為定量指標(biāo)更恰當(dāng)[13-20]。本實(shí)驗(yàn)建立的方法可以同時(shí)測定治糜康栓中苦參堿和氧化苦參堿的含量，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可以更加全面地評價(jià)治糜康栓的質(zhì)量狀況。由于本實(shí)驗(yàn)研究的樣品數(shù)量少，尚無法制定該制劑的最佳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，今后將逐步積累數(shù)據(jù)，為制定治糜康栓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:1部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2015:111.

[2]李曉燕,趙韶華,等.苦參堿含量測定中色譜條件的改進(jìn)[J].中成藥, 2004, 26(2):172-173.

[3]羅明,賀平,吳孟超,等.高效毛細(xì)管電泳法測定苦參堿和氧化苦參堿[J].中草藥, 1999, 30:(4):26.

[4]劉瑩,孟慶妍,翟宏宇. HPLC法同時(shí)測定復(fù)方苦參腸炎康片中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011, 27(5):842-843.

[5]唐坤,李標(biāo),夏晨燕,等.反相高效液相色譜測定清益康乳膏中苦參堿的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(8):1829-1830.

[6]毛丹,陳鈳. HPLC法測定苦參軟膏中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿[J].中成藥, 2011, 33(9):1531-1534.

[7]張蕾,陳曉輝. RP-HPLC法測定苦參中苦參堿的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 22(1):33-35.

[8]吳春紅,唐衛(wèi)文. HPLC法測定苦參藥材中苦參堿的含量[J].藥物分析雜志, 2008, 28(7):1147-1149.

[9]時(shí)曉亞,方寶霞.高效液相色譜法測定復(fù)方苦參子洗液中苦參堿與氧化苦參堿的含量[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,3(28):288-290.

[10]楊文遠(yuǎn),楊寧蓮. HPLC法同時(shí)測定苦豆子中苦參堿與氧化苦參堿[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 17(4):13.

[11]吳迪,梁健. RP-HPLC法同時(shí)測定復(fù)方苦參注射液中氧化槐果堿、氧化苦參堿和苦參堿的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 23(4):220-223.

[12]石猛,莫尚志.醇沉法存在的問題及解決辦法[J].中藥材,1999, 22(6):313-314.

[13]陳宏降,李祥,陳建偉,等.中藥三白草地上部位的化學(xué)成分研究(Ⅰ)[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 25(4):286.

[14]鄧惠文,歐子強(qiáng),李元文,等.中藥蛇床子中黃酮類成分的研究[J].廣州化工, 2009, 37(6):105-106,114.

[15]孫文基,賈敏鴿.苦參及其復(fù)方中苦參堿與氧化苦參堿的轉(zhuǎn)化研究[J].藥物分析雜志, 2003, 23(2):90-93.

[16]江維克,王麗. HPLC法同時(shí)測定復(fù)方石韋片和苦參藥材中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中成藥, 2005,27(1):45-48.

[17]楊志欣,王海威,張文君,等.苦參總黃酮含量測定方法的優(yōu)化[J].中成藥, 2017, 39(5):946-951.

[18]計(jì)曼艷,曾琨,王華. HPLC-DAD法同時(shí)測定中藥苦參中七種生物堿成分的含量[J].中國藥師, 2017, 20(1):60-63.

[19]付起鳳,曹琦,呂邵娃,等.正交法優(yōu)化苦參中苦參生物堿的超聲提取工藝[J].中醫(yī)藥信息, 2015, 32(1):11-13.

[20]王秀蘭,洪宗超,吳松濤,等.高效液相色譜法測定復(fù)方苦參湯中苦參堿、氧化苦參堿的含量[J].藥物分析與檢驗(yàn), 2017, 15(10):1426-1429.