一步法合成甘草次酸甲酯及其結(jié)構(gòu)研究

王海霞，陳齊齊，劉婷婷，趙雙雙，吳 勇*，胡冬華*

（1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；2. 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司中藥研究院，江蘇 泰州 225321）

甘草又名美草、甜草、蜜草[1]，大多分布在我國(guó)西北、華北、東北地區(qū)，是一種用途十分廣泛的中藥材[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-6]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其有效成分進(jìn)行了大量深入的研究，包括提取、分離、結(jié)構(gòu)改造、藥理作用、臨床應(yīng)用等方面。其中對(duì)甘草酸和甘草次酸的研究最為廣泛，甘草酸具有保肝解毒、抗病毒、抗炎以及增強(qiáng)免疫功能等作用，隨著對(duì)其深入研究及臨床應(yīng)用表明，甘草酸對(duì)胃腸道有刺激作用，可引起假性醛固酮增多癥[7]，其表現(xiàn)是心臟和肌肉運(yùn)作異常[8]。本研究以降低甘草酸的假性醛固酮增多癥毒副作用為目的對(duì)甘草酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造及合成條件優(yōu)化，并在較低溫度下，采用一步法合成甘草次酸的衍生物——甘草次酸甲酯，并對(duì)其合成條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與材料

78-1型磁力加熱攪拌器，AL 204分析天平，SHZCB型循環(huán)水式真空泵，WFH-203三用紫外線(xiàn)分析儀，INOVA-500核磁共振儀，X-5精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，ZK-82B型電熱真空干燥箱，TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，YLE-2000恒溫水浴鍋，瑞利紅外光譜儀。甘草酸98%，甘草次酸97%，甲醇，乙醇，鹽酸，三氯甲烷，石油醚，甲苯，乙酸乙酯，濃硫酸，苯，乙酸，溴化鉀，以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草次酸甲酯的合成 稱(chēng)取甘草酸1.0 g置于50 mL燒杯中，加入10% HCl 10 mL、甲醇5 mL，室溫?cái)嚢?2 h后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，于烘箱90 ℃下反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，取出，冷卻至室溫，過(guò)濾，將所得沉淀用水多次洗滌至無(wú)醇味，置50 ℃烘箱中干燥24 h。將所得干燥物用80%乙醇進(jìn)行反復(fù)重結(jié)晶即得甘草次酸甲酯。

2.2 合成條件優(yōu)化

2.2.1 正交因素、水平的確定 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]影響甘草次酸甲酯合成主要的因素有反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及催化劑種類(lèi)、濃度。本試驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及鹽酸的濃度對(duì)合成產(chǎn)率的影響，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表。因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 采用正交試驗(yàn)方法，以甘草次酸甲酯的產(chǎn)率為考察指標(biāo)，考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和鹽酸濃度3個(gè)因素對(duì)合成產(chǎn)率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀(guān)分析L9（34）

表3 方差分析表L9（34）

由方差分析表可知，各因素對(duì)合成甘草次酸甲酯反應(yīng)的影響大小順序?yàn)椋珹＞B＞C，即反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞鹽酸濃度。由均值分析可知，最佳合成條件為A1B1C3，即反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間12 h、鹽酸濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）10 %。本實(shí)驗(yàn)方法一步合成目標(biāo)產(chǎn)物，合成條件更為溫和，產(chǎn)物純度高，合成效率好。

2.3 甘草次酸甲酯結(jié)構(gòu)研究

2.3.1 物理性質(zhì) 合成產(chǎn)物甘草次酸甲酯為白色粉末狀晶體，于顯微鏡下觀(guān)察為細(xì)小的白色針狀結(jié)晶。通過(guò)溶解實(shí)驗(yàn)得知其易溶于氯仿，溶于乙醇、甲醇等，難溶于水。通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)得其熔點(diǎn)為246～250 ℃（文獻(xiàn)值250～251 ℃）[8]。

2.3.2 薄層層析鑒定 考察了不同展開(kāi)劑系統(tǒng)，選用石油醚-甲苯-乙酸乙酯-乙酸進(jìn)行展開(kāi)。樣品為2 mg/mL的三氯甲烷溶液，吸附劑為硅膠G；展開(kāi)劑：石油醚 : 甲苯 : 乙酸乙酯 : 乙酸 = 5 : 10 : 3.5 : 0.28；顯色劑：30 %硫酸溶液；置于365 nm紫外光燈下檢視，結(jié)果：甘草次酸甲酯為甘草次酸的衍生物，其結(jié)構(gòu)與甘草次酸不同之處在于甲氧基和羥基，故兩者極性有差異。合成產(chǎn)物（標(biāo)記2）的Rf值大于甘草次酸（標(biāo)記1）的Rf值。由此得知該合成產(chǎn)物的極性小于甘草次酸，符合化合物發(fā)生酯化后的特征規(guī)律。

2.3.3 紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析 取經(jīng)純化產(chǎn)物0.5 mg溶于100 mL 80 %乙醇中，以80 %乙醇為空白對(duì)照，置于TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果合成產(chǎn)物甘草次酸甲酯有2個(gè)特征吸收峰，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 甘草次酸甲酯紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描結(jié)果

2.3.4 紅外吸收光譜分析 將經(jīng)純化的產(chǎn)物置于烘箱中干燥，取1.5 mg，與200目干燥的KBr粉末（光譜純）約200 mg，置于瑪瑙乳缽中，用研杵研細(xì)并混合均勻，壓成直徑約13 mm、厚度約1 mm的透明KBr樣品片，利用紅外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。結(jié)果可知，νas（-COOCH3）為1 726.59 cm-1，是酯類(lèi)化合物的第一特征峰；νas（-C-O-C-）為 1 217.26 cm-1、1 156.14 cm-1，是酯的第二特征峰；νas（O=C＜）為1 658.18 cm-1；νas（-OH）為 3 428.66 cm-1；νas（=C-H）為 994.23 cm-1，νas（-CH3）為 2 947.62 cm-1、1 464.20 cm-1、1 386.76 cm-1，這些特征吸收峰與甘草次酸甲酯結(jié)構(gòu)都十分吻合，可以初步確定該合成產(chǎn)物為甘草次酸甲酯。

2.3.5 核磁共振波譜 核磁共振波譜在化合物結(jié)構(gòu)確定方面具有重要作用，應(yīng)用廣泛，測(cè)定結(jié)果可靠。本研究采用核磁共振波譜檢測(cè)，合成產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果：

1H-NMR（600MHz，CDCl3） d：7.25（CDCl3，5.64（s，1H，12-H），3.71（s，3H，-COOCH3），3.22（m，1H，3-H），2.79（m，1H，18-H），2.23（s，1H，9-H），1.50～1.01（m，6H），1.70～1.58（s，3H，27-H），1.20～ 1.14（m，1H），1.19（s，3H，30-H），1.13（s，3H，25-H），1.16（s，3H，26-H），1.07～0.99（m，2H，1-H），1.02（s，3H，23-H），0.81（s，3H，CH3），0.80（s，3H，CH3），0.74～0.60（m，1H，5-H）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]值相符，表明該合成產(chǎn)物為甘草次酸甲酯。

3 討論

甘草酸屬于五環(huán)三萜類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)中的羰基和羧基是甘草酸發(fā)揮藥效時(shí)引起不良反應(yīng)的主要基團(tuán)，因此本研究針對(duì)其中的羧基和葡萄糖醛酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成目標(biāo)化合物甘草次酸甲酯。文獻(xiàn)中關(guān)于甘草次酸甲酯的合成主要有兩種方法，一種是先在高溫高壓條件下以酸為催化劑將甘草酸進(jìn)行水解，生成甘草次酸；然后在酸存在的條件下甘草次酸與甲醇進(jìn)一步進(jìn)行酯化反應(yīng)[9]，另一種是采用克萊門(mén)森還原的方法[12]。本研究采用一步水熱法合成甘草次酸甲酯，省去了甘草酸單獨(dú)進(jìn)行水解的步驟，實(shí)驗(yàn)中所用的酸既可以催化甘草酸水解，又可以作為酯化反應(yīng)的催化劑，節(jié)省了原料，避免了中間過(guò)程的物料損失；提高了產(chǎn)品的產(chǎn)率；產(chǎn)物的純化通過(guò)反復(fù)重結(jié)晶即可完成，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度較高。

本研究結(jié)果證明，甘草次酸甲酯具備甘草酸的基本藥用價(jià)值，比如治療肝損傷、抗?jié)儭⒖寡椎然钚浴５歉什荽嗡峒柞ケ雀什菟岣哂袃?yōu)越性，其假性醛固酮增多癥毒副作用大大降低[13]，并且脂溶性更好，更有利于人體吸收。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2015.

[2]李海華,青梅.甘草的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015(2):199-204.

[3]李玉山.甘草酸提取純化工藝的研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑,2016, 38(5):428-432.

[4]金京麗,尹明浩.淺述甘草古今運(yùn)用[J].吉林中醫(yī)藥,2006, 26(4):52-53.

[5]張利.甘草的藥理作用及現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中醫(yī)臨床研究,2014, 6(10):147-148.

[6]周彪,萬(wàn)傳星.甘草地上部分化學(xué)成分研究[J].中草藥,2016, 47(1):21-25.

[7]吳楠.甘草次酸衍生物藥效學(xué)篩選及相關(guān)機(jī)制的探討[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué), 2006.

[8]覃瑤,王欣.甘草次酸衍生物的抗炎活性及水鈉潴留作用的研究[J].華西藥學(xué)雜志, 2013, 28(4):338-340.

[9]劉文叢,羅云清.水熱法合成甘草次酸甲酯的研究[J].東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 39(4):154-156.

[10]陳蘭,李貴香.系列甘草次酸衍生物的合成與波譜測(cè)定[J].中國(guó)藥房, 2014(3):249-252.

[11]韓亞男,程新宇,侯俊玲,等.大孔樹(shù)脂純化甘草地上部分總黃酮的工藝[J].吉林中醫(yī)藥, 2014, 34(1):82-86.

[12]雍建平.阿吉艾克拜爾·艾薩.甘草次酸/11-脫氧甘草次酸甲酯的合成[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2011, 22(11):2618-2619.

[13]木合布力·阿布力孜,馬淑燕,閔杰.甘草次酸的結(jié)構(gòu)修飾研究進(jìn)展[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 30(2):185-187.