番茄果膠和半纖維素抗氧化活性分析

李倩倩,李武筍,桑偉娜,王麗敏,趙玉梅,曹建康

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

果膠是植物細胞壁的重要組成之一,是由β-D-半乳糖醛酸(β-D-Galacturonic Acid,GalUA)通過α-1,4-糖苷鍵連接而成、部分甲酯化的多聚物[1]。從植物細胞壁中提取的果膠已作為膠凝劑、增稠劑、穩定劑和乳化劑,廣泛應用于食品、化妝品、保健品和藥品等行業。此外,果膠還具有較好的抗氧化活性、降血糖、降低血清膽固醇和預防腸胃疾病、抗癌、抗炎等作用[2-3]。半纖維素以共價鍵連接到果膠或以氫鍵連接到纖維素上[4],在生物醫藥上也有應用潛力,尤其是木聚糖,具有較好的免疫刺激行為、抗補體行為、抑制腫瘤能力和抗發炎能力[5]。其中,抗氧化活性是很多生物活性功能的基礎[2],得到了較多的關注。研究發現,柑橘[6]、蘋果[3]、山楂[7]、南瓜[8]、山竹[9]等果實的果膠都具有一定的抗氧化活性。由于植物細胞壁中果膠存在狀態與結合方式不同,利用不同方法提取的果膠在組成和性質上有較大的差異。根據在不同溶劑中的溶解性,可分步從果實細胞壁中分離提取得到WSP、CSP和SSP[10],還可繼續分離提取得到不同結合程度的半纖維素組分。目前關于不同類型果膠和半纖維素的研究多集中在它們與果實質地變化之間的關系上[11-12],然而,到目前為止,還未見到不同類型果膠和半纖維素抗氧化活性的報道。

番茄是世界上種植量最多和消費量最大的果蔬作物之一。果膠對番茄鮮果品質和番茄加工制品如番茄醬、番茄汁等質量有很大影響。此外,果膠和半纖維素是提取番茄紅素后皮渣中的重要成分。本文擬研究番茄細胞壁提取物中不同類型的果膠和半纖維素的體外抗氧化活性,為番茄的綜合加工利用和作為功能性食品添加成分的開發提供了理論根據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄 市售堅熟期,品種為‘609’,選擇成熟度、大小一致的果實,硬度為(4.14±0.86) kg/cm2,可溶性固形物含量為4.66%±0.45%;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox) Sigma 試劑公司;2,4,6-三吡啶基-S-三嗪(TPTZ) 艾科試劑公司;熒光素鈉、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH) 麥克林試劑公司;乙醇、丙酮、α-萘酚、乙二胺四乙酸(EDTA)、硼氫化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀、半乳糖醛酸、咔唑、蔗糖、蒽酮、乙酸乙酯、甲醇、過硫酸鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、氫氧化鈉等 均為分析純,北京試劑公司;濃硫酸 優級純,北京試劑公司。

A11液氮研磨機 德國IKA;H/T 16 MM高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;DZF-6050B真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;RE-52旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;LGJ-10B冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;紫外可見分光光度計(T6新世紀) 北京普析通用儀器有限責任公司;Cary Eclipse熒光分光光度計 美國VARIAN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 番茄果膠和半纖維素的提取與分離

1.2.1.1 番茄乙醇不溶物質的制備 參照Huber等[13]的方法制備。稱取番茄1 kg,去籽,切分后用液氮研磨機粉碎。稱取200 g粉碎樣品置于研缽中,加入800 mL 95%(v/v)乙醇溶液研磨成勻漿,轉移至三角瓶中,煮沸30 min,冷卻后抽濾,收集濾渣,再加入等量80%(v/v)乙醇溶液重復上述步驟3次,再用丙酮攪拌沖洗濾渣3次。最后將得到的濾渣在40 ℃烘干至恒重,即得乙醇不溶物質。

1.2.1.2 不同類型果膠和半纖維素的分離 參考Brummell等[14]的方法分離。稱取上一步得到的乙醇不溶物質2 g,加入20 mL去離子水,室溫下振蕩提取4 h,抽濾,收集濾液。向濾渣中再加入去離子水重復提取2次,合并3次濾液即為WSP。收集濾渣,加入20 mL 50 mmol/L EDTA溶液(pH6.5,含100 mmol/L NaAc),按照上述方法提取3次,合并濾液即為CSP。收集濾渣,加入20 mL 50 mmol/L Na2CO3溶液(含20 mmol/L NaBH4),按照上述方法提取3次,合并濾液即為SSP。提取SSP之后的濾渣用來提取細胞壁半纖維素成分,根據Maclachlan等[15]的方法分別用20 mL 4%和24% KOH(W/V)(含20 mmol/L NaBH4)提取LH和TH,各提取3次,合并3次所得濾液。用醋酸分別中和所得SSP、LH和TH提取液至pH為6.5。將上述操作得到的五種提取液用去離子水透析,所用透析袋截留分子量為3000 Da。透析液經50 ℃旋轉蒸發濃縮,再冷凍干燥后保存在干燥器中。

1.2.2 果膠和半纖維素含量的測定

1.2.2.1 果膠含量測定 采用咔唑比色法測定不同溶解性果膠的含量[16]。以每克鮮重番茄所含有的半乳糖醛酸(GalUA)的毫克數表示果膠含量。

1.2.2.2 半纖維素含量測定 采用蒽酮試劑法測定不同結合程度半纖維素的含量[16]。以每克鮮重番茄所含有的葡萄糖(Glu)的毫克數表示半纖維素含量。

1.2.3 體外抗氧化活性測定

1.2.3.1 ORAC的測定 參照Song 等[17]的方法測定。用75 mmol/L的磷酸鈉緩沖溶液(pH7.4)分別配制不同濃度樣品、100 μmol/L Trolox溶液、0.96 μmol/L熒光素鈉溶液和119 mmol/L的AAPH溶液,以磷酸鈉緩沖液代替樣品為空白對照,以Trolox溶液為標準品。在96孔黑色板中先分別加入20 μL空白、標樣或不同濃度樣品,再加入200 μL熒光素鈉溶液,37 ℃水浴 20 min并間歇振蕩。然后加入20 μL現配的AAPH,迅速將96孔板放入熒光分光光度計,在激發波長485 nm,發射波長538 nm下測定熒光強度的動態變化,每4.5 min測定一次,共測定35次;以標樣濃度為橫坐標,以標樣峰面積減去空白峰面積之差為縱坐標,制作標樣ORAC曲線。計算各樣品峰面積減去空白峰面積的值,通過查標準曲線,以具有相同氧自由基吸收能力的Trolox濃度表示不同樣品的ORAC值。

1.2.3.2 DPPH·清除能力的測定 參照Li 等[18]的方法測定。

1.2.3.3 ABTS+·清除能力的測定 參照Li 等[18]的方法測定。

1.2.3.4 FRAP的測定 參照劉慧等[19]的方法測定。以FeSO4·7H2O為標準品,繪制標準曲線,不同濃度樣品的鐵離子還原能力表示為具有相同還原能力的FeSO4·7H2O的濃度。

1.3 數據分析

實驗重復3次,采用Microsoft Excel 2013和SPSS 21.0軟件進行數據分析,測定結果以平均值±標準誤表示。采用ANOVA進行鄧肯式(Duncan’s)多重比較差異分析,以p<0.05為差異顯著。對各指標進行相關性分析,相關類型為pearson類型,相關系數顯著性檢驗采用雙側檢驗,以p<0.05 為顯著相關,以p<0.01 為極顯著相關。

2 結果與分析

2.1 番茄不同溶解性果膠和半纖維素的含量

果膠和半纖維素是植物細胞壁中的重要成分。番茄細胞壁中不同溶解性的果膠和半纖維素含量如表1所示。番茄WSP、CSP和SSP含量分別為1.05、0.64和0.62 mg GalUA/g FW。WSP主要為溶解在質外體中的組分[20-21],能增強果實汁液粘稠狀態。CSP又稱離子結合型果膠,主要是與細胞壁其它成分以離子鍵或氫鍵相結合的果膠,往往能與鈣橋相結合而形成“蛋殼模型”[22],在果實軟化過程中逐漸溶解。SSP又稱共價結合型果膠,主要是以共價鍵和纖維素等細胞壁成分緊密結合的果膠[23]。番茄LH與TH的含量分別為0.09和0.33 mg Glu/g FW,差異顯著(p<0.05)。這與前人的報道結果一致[23]。細胞壁物質往往結合緊密,需要用強堿水解。24% KOH比4% KOH能夠明顯有效地水解番茄細胞壁,使緊密連接在細胞壁上的半纖維素與其它成分分離。

表1 番茄中不同類型果膠和半纖維素的含量Table 1 Contents of different pectins and hemicelluloses in tomato fruit

注:同列不同小寫字母表示存在顯著性差異(p<0.05);-表示未測定。

2.2 番茄不同溶解性果膠和半纖維素的體外抗氧化活性

2.2.1 ORAC ORAC法是目前生理相關性最高的測定試樣總抗氧化活性的方法[24]。在番茄細胞壁各組分中,除TH外,果膠組分和LH均具有一定的ORAC活性(圖1)。0.1 mg/mL WSP溶液的ORAC值相當于33.2 μmol/L Trolox,但隨著濃度的增加,WSP溶液的ORAC活性并沒有隨之增加。然而,CSP溶液的ORAC活性隨著濃度的增加而顯著升高(p<0.05),特別是在濃度為1和5 mg/mL 時的ORAC值分別為71.0和76.1 μmol/L Trolox,顯著高于其它組分的ORAC值(p<0.05)。相對而言,SSP和LH溶液的ORAC活性較低,甚至在低濃度時檢測不到。目前僅Wang等報道了葡萄柚皮總果膠的ORAC活性[25],但有關不同類型果膠和半纖維素組分ORAC活性的研究尚未見報道。不同溶解性果膠的分子組成和多糖聚合物的構成不同,可能導致它們在總抗氧化活性上的差異,與細胞壁結合程度不同的半纖維素,也可能在組成上存在較大差異,引起總抗氧化活性的變化?？寡趸钚耘c反應物質的電子得失和反應溶液中電荷的轉移有關。細胞壁組分為多糖大分子物質,多糖大分子物質溶液的物理特性如膠凝性、流變性、膠粒電荷分布特性等隨著濃度的升高而變化[26]。因此,不同濃度的果膠和半纖維素抗氧化活性的變化還可能與大分子溶液在不同濃度的物理性質變化有關。

圖1 番茄中不同類型果膠和半纖維素的氧自由基吸收能力Fig.1 Oxygen radical absorbance capacity of different pectins and hemicelluloses in tomato fruit注:相同的小寫字母表示不存在 顯著性差異(p>0.05);圖2～圖4同。

2.2.2 DPPH·清除能力 DPPH·清除能力是評價生物活性成分清除自由基能力最廣泛使用的方法之一。如圖2所示,WSP在5 mg/mL時清除DPPH·的能力為14.5%,在較低濃度時清除能力降低或消失。CSP清除DPPH·的能力隨著濃度增大而增強,在5 mg/mL時DPPH·清除率達到61.0%,顯著高于番茄細胞壁其它4種類型的組分的DPPH·清除能力(p<0.05)。不同濃度SSP、LH和TH都具有一定的DPPH·清除能力,但是卻隨著溶液濃度的增大而降低。SSP、LH和TH均是通過較強的堿溶液水解番茄細胞壁物質得到的產物,是結構復雜的大分子物質。較高濃度的SSP、LH和TH溶液由于物理性質的變化,可能阻礙了抗氧化基團與自由基反應,使得高濃度細胞壁組分溶液清除自由基的能力反而較低[27]。

圖2 番茄中不同類型果膠和半纖維素的DPPH·清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging capacity of different pectins and hemicelluloses in tomato fruit

2.2.3 ABTS+·清除能力 如圖3所示,番茄細胞壁各組分都具有一定的ABTS+·清除能力,且均隨著濃度的增加而增強。這與前人報道的蘋果總果膠[28]、蘋果渣總果膠[29]和黑莓果膠寡糖[30]等的規律一致。WSP在5 mg/mL時ABTS+·清除能力達到62.2%。濃度為5 mg/mL的CSP對ABTS+·清除能力分別達到66.4%、50.2%和13.6%。

表2 番茄不同類型果膠和半纖維素與抗氧化活性的相關系數(r)Table 2 Correlation coefficients(r)of different pectins,hemicelluloses and antioxidant activity of tomato fruit

注:*表示顯著相關(p<0.05);**表示極顯著相關(p<0.01);aTH未檢測到ORAC值,未能計算。清除率達到99.8%,顯著高于其它組分(p<0.05)。SSP、LH和TH在濃度為5 mg/mL時ABTS+·

圖3 番茄中不同溶解性果膠 和半纖維素的ABTS+·清除能力Fig.3 ABTS radical scavenging capacity of different pectins and hemicelluloses in tomato fruit

2.2.4 FRAP FRAP常用于評價生物活性成分的總抗氧化能力[31]。如圖4所示,WSP和CSP的FRAP水平基本一致,隨著濃度的增大而略有增強。SSP、LH和TH的FRAP能力隨著濃度增大而顯著增強(p<0.05)。其中5 mg/mL的SSP、LH和TH的FRAP值分別相當于1866.7、1851.9和1481.5 μmol/L FeSO4/mL。與前文番茄細胞壁各組分的ORAC、DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力抗氧化指標相比較發現,CSP的FRAP能力較弱,而SSP、LH和TH卻表現出較強的FRAP還原能力。這可能與體外抗氧化活性評價體系中,不同指標的反應原理不同有關[32]。

圖4 番茄中不同溶解性細胞壁多糖的鐵離子還原能力Fig.4 Ferric reducing antioxidant power of different pectins and hemicelluloses in tomato fruit

2.3 番茄果膠和半纖維素與抗氧化活性的相關性

對番茄中不同類型的果膠和半纖維素與抗氧化活性進行了相關性分析,結果如表2所示。WSP與DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力存在極顯著相關性(p<0.01)。CSP與DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力存在極顯著相關性(p<0.01),與ORAC、FRAP存在顯著相關性(p<0.05)。SSP與ABTS+·清除能力、FRAP存在極顯著相關性(p<0.01),但是與DPPH·清除能力存在顯著負相關性(p<0.05)。LH與ABTS+·清除能力、FRAP存在極顯著相關性(p<0.01),但與DPPH·清除能力存在顯著負相關性(p<0.05)。TH與DPPH·清除能力存在極顯著負相關性(p<0.01),與ABTS+·清除能力、FRAP具有顯著相關性。不同抗氧化指標之間一般呈現顯著或極顯著正相關[33]。但是,由于不同測定方法的反應原理不同,以及番茄細胞壁各組分大分子溶液物理性質隨濃度變化的影響,導致個別抗氧化指標間的相關性出現差異,如ORAC與FRAP存在極顯著負相關(p<0.01)。

3 結論

利用溶解性和結合程度差異,分步提取番茄果皮細胞壁物質,得到WSP、CSP、SSP、LH和TH 5種組分,其中WSP含量顯著高于CSP和SSP,TH含量顯著高于LH(p<0.05)。這些果膠組分和半纖維素組分均表現出一定的ORAC、DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和FRAP體外抗氧化活性,并且相關性分析表明各組分與抗氧化活性密切相關。由于各組分之間結構和組成的差異,導致它們的功能特性存在差異。其中,CSP的ORAC、DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力較強,綜合抗氧化活性較強,而SSP、LH和TH具有較強的FRAP能力。番茄果皮的果膠和半纖維素具有較強的綜合加工利用潛力,未來可開發為功能性食品添加成分。

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