紅棗色素的抗脂質過氧化作用

韓婭婷,謝 惠,邵佩蘭,張麗芬,鄭安然

(寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

自由基過剩可誘發許多慢性疾病,如惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、免疫失調等多種疾病,亦是機體衰老的機制之一[1]。脂質過氧化在過氧化脂質損傷細胞模型中是氧自由基損傷組織的重要方式,生物膜含有的多不飽和脂肪酸極易受活性氧進攻而發生脂質過氧化[2-3],產生的氧化產物會導致不同程度的生化代謝紊亂及病理變化,同時,紅細胞膜發生脂質過氧化反應還會使血小板凝集,誘發腦血栓、心肌梗塞等[4]。研究發現,植物中天然抗氧化物可消除人體代謝過程中多余的內源性活性氧,阻斷自由基對體內大分子物質如DNA的氧化和損傷,減少心腦血管疾病發生[5],因此研究和開發具有抗脂質氧化活性的物質對防治與自由基有關的疾病有重要意義。

從加工棗汁的廢棄棗渣中提取的紅棗色素,色澤鮮艷、安全無毒,且具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、補血養氣等功效[6],是一種較為理想的天然色素資源。目前紅棗色素的研究多集中于提取[7]及穩定性[8],馬奇虎[9]、鄭安然[10]等研究認為該色素為水溶性色素,其主要成分是黃酮類化合物。鄭安然[11]、李勇[12]等研究表明紅棗紅色素具有較好的體外抗氧化活性,且多酚和黃酮可能是其抗氧化作用的主要物質基礎[13],但紅棗色素的抗脂質過氧化能力研究未見報道,本實驗通過大豆油、卵黃脂蛋白、亞油酸、小鼠肝臟勻漿、小鼠紅細胞脂質過氧化體系,研究紅棗色素對脂質過氧化的抑制作用,以期為紅棗色素的開發利用,天然抗氧化劑的篩選及慢性退行性疾病的預防等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗色素 食品化學與分析實驗室自制[7];健康雄性ICR小鼠 體重18～20 g,5周齡,寧夏醫科大學實驗動物中心;硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、硫酸亞鐵、三氯甲烷(CHCl3)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞油酸、過氧化氫(H2O2)、正丁醇、抗壞血酸(VC) 均為分析純;大豆油(不添加任何抗氧化劑) 山東魯花集團有限公司;雞蛋 銀川市市售。

UV-2000型紫外分光光度儀 上海尤尼柯儀器有限公司;TDL-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠;90型磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠;玻璃組織勻漿器 沈陽玻璃儀器一廠;SHA-C水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 天津匯科儀器設備有限公司;101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海車星建材實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅棗色素對大豆油脂質過氧化的抑制作用 稱取10 mL大豆油,加入1 mL蒸餾水稀釋的0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 mg/mL紅棗色素溶液,于48 ℃水浴恒溫22 h,取樣1 mL加入2 mL 0.67% TBA溶液,2 mL 20% TCA,沸水浴20 min,冷卻至37 ℃,加入5 mL CHCl3溶液,搖勻,離心(3500 r/min,10 min),取上清液于532 nm處測吸光度[14],空白對照以蒸餾水代替紅棗色素溶液,并以VC做陽性對照,計算抑制率。

抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100

1.2.2 紅棗色素對Fe2+誘發卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制作用 新鮮雞蛋去卵清,卵黃用等體積pH7.4,0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)配制成1∶1的懸液,磁力攪拌(37 ℃)10 min,再用PBS稀釋成1∶25的卵黃懸液。取卵黃懸液0.2 mL,分別加入0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 mg/mL紅棗色素溶液1 mL,再加入25 mmol/L FeSO4·7H2O溶液0.2 mL,用PBS補至2 mL,對照管除不加色素溶液外其他試劑同前,將對照管、樣品管同置于37 ℃水浴4 h,取出加50% TCA溶液0.5 mL,0.8% TBA 1 mL,混勻,100 ℃水浴20 min,冷卻,3500 r/min離心15 min,取上清液在532 nm處測定吸光度[15],并以VC做陽性對照,計算抑制率。

抑制率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100

1.2.3 紅棗色素對亞油酸脂質過氧化的抑制作用 將紅棗色素加入2.5%亞油酸-無水乙醇溶液(1∶40)配制成0.01、0.05、0.10 mg/mL色素溶液,并以VC做陽性對照,混勻后置于40 ℃培養箱。每隔1 d(共4 d),取出1 mL待測樣品,加入1 mL 25% TCA混勻,靜置20 min后加入1 mL 0.67% TBA,沸水浴加熱10 min。冷卻后加入4 mL正丁醇,搖勻,4000 r/min,室溫離心10 min,取上層液于532 nm處比色,用蒸餾水代替樣品做空白,同時測定不加抗氧化物的空白管吸光度[15],計算抑制率。

抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100

1.2.4 紅棗色素對Fe2+催化亞油酸脂質過氧化的抑制作用 在10 mL 0.2 mol/L pH7.4 PBS中,加入2.5%亞油酸乙醇液4.1 mL,蒸餾水4.9 mL,并加入1 mL 2.54×10-3g/L的FeSO4作催化劑形成底物溶液,加紅棗色素使其成為0.01、0.05、0.10 mg/mL色素溶液,并以VC做陽性對照,混勻后置于40 ℃培養箱。定時取出1 mL待測樣品,其他操作同1.2.3[15]。

抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100

1.2.5 紅棗色素對小鼠肝組織自發性脂質過氧化的抑制作用 小鼠禁食過夜,次日處死。迅速取出肝臟,置于4 ℃生理鹽水中反復漂洗,吸干水分,稱重。剪碎,在冰浴條件下用生理鹽水研磨,制成10%肝組織勻漿,4 ℃以3000 r/min離心10 min,取上清液待用。取肝勻漿1 mL于試管中,加入0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL紅棗色素溶液1 mL,對照管以蒸餾水代替紅棗色素溶液,混勻,37 ℃水浴恒溫振蕩(振蕩速率為200 r/min)1.5 h,加10% TCA 2 mL,0.67% TBA 1 mL,混勻,沸水浴加熱15 min,冷卻至37 ℃,3000 r/min離心(4 ℃)15 min,取上清液在532 nm處比色[16],并以VC做陽性對照,計算抑制率。

抑制率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100

1.2.6 紅棗色素對H2O2誘導小鼠肝組織脂質過氧化的抑制作用 取1 mL肝勻漿溶液,加入0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL紅棗色素溶液0.1 mL,加入0.1 mL 60 mmol/L H2O2,37 ℃水浴1 h,加入15% TCA 1 mL終止反應,再加0.67% TBA 1 mL,沸水浴加熱15 min,冷卻至37 ℃,4 ℃以3000 r/min離心10 min,于532 nm測上清液吸光度[16],空白對照以蒸餾水代替紅棗色素溶液,并以VC做陽性對照,計算脂質抑制率,以丙二醛(MDA)抑制率來表示。

抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100

1.2.7 紅棗色素對H2O2誘導的紅細胞膜脂質過氧化 小鼠禁食過夜,眼球采血1 mL到含抗凝劑的離心管里,用生理鹽水5 mL洗滌3次(3000 r/min,4 ℃),每次5 min,棄上層液,將紅細胞配制成0.5%懸浮液。取紅細胞懸液0.5 mL加入到對照管、加藥管,各管加生理鹽水1 mL,加藥管加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL紅棗色素溶液0.05 mL,對照管、加藥管加100 mmol/L H2O20.1 mL,用生理鹽水補足至2 mL,搖勻,37 ℃水浴2 h,加入20% TCA 0.3 mL,0.1 mol/L HCl 2 mL,3500 r/min離心(4 ℃)15 min,取上清液3 mL加入0.67% TBA 1 mL,沸水浴15 min,冷卻后于532 nm處測吸光度[17],并以VC做陽性對照,計算抑制率。

抑制率(%)=(A對照管-A加藥管)/A對照管×100

1.2.8 紅棗色素對H2O2誘導紅細胞溶血的抑制作用 取0.5%紅細胞懸液1 mL,加入到空白管、對照管和樣品管,樣品管加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL紅棗色素溶液0.05 mL,對照管、樣品管加入100 mmol/L H2O20.05 mL,空白管、對照管加生理鹽水補足至1.1 mL,搖勻37 ℃水浴1 h,各管加生理鹽水4 mL,3000 r/min離心10 min,取上清液于425 nm處測吸光度[17],并以VC做陽性對照,計算抑制率。

抑制率(%)=(A對照管-A樣品管)/(A對照管-A空白管)×100

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 紅棗色素對大豆油脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素對大豆油脂質過氧化的抑制作用見圖1。由圖1可知,紅棗色素具較好的抑制大豆油脂質過氧化能力,且隨紅棗色素濃度增加,抑制能力逐漸增強,并呈良好量效關系。低濃度時增幅較緩,高于0.5 mg/mL時增幅顯著增大(p<0.01),1.5 mg/mL時抑制能力為0.5 mg/mL時的3.3倍,且稍強于VC,IC50為0.96 mg/mL(VC的IC50為1.07 mg/mL)。紅棗色素含有黃酮和多酚類化合物(含量為3.2 mg/g和12.58 mg/g),其酚羥基結構中的鄰位酚羥基很容易氧化成醌類結構而具有很強的供氫能力,可與脂肪酸自由基結合,終止自由基的連鎖反應[18],使紅棗色素具有較好的抑制大豆油脂質過氧化能力。

圖1 紅棗色素對大豆油脂質過氧化的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of jujube pigment on the bean oil lipid peroxidation

2.2 紅棗色素對Fe2+誘發卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素對Fe2+誘發卵黃脂蛋白脂質過氧化有一定的抑制作用(圖2),且隨紅棗色素濃度增加抑制作用增強(p<0.05),低濃度紅棗色素的抑制能力與VC相差不大,0.5 mg/mL以上時抑制能力較VC弱,1.5 mg/mL紅棗色素的抑制率為45.30%±1.54%,明顯低于VC(71.00%±1.00%)。卵黃磷脂C-2位上所含多不飽和脂肪酸在Fe2+催化下易發生脂質過氧化,而紅棗色素中酚類物質可釋放H+,破壞或終止氧化產生的過氧化物,并分解為醛、酮類低分子物質[19]而抑制脂質過氧化。

圖2 紅棗色素對Fe2+誘發卵黃脂 蛋白脂質過氧化的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of jujube pigment on the yolk lipoprotein lipid peroxidation induced by Fe2+

2.3 紅棗色素對亞油酸脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素對亞油酸脂質過氧化有一定的抑制作用(圖3),且隨紅棗色素濃度的增加,抑制作用逐漸增強(p<0.05)。0.01 mg/mL紅棗色素與同濃度VC的抑制率相差不大,0.10 mg/mL紅棗色素在第4 d的抑制率達59.92%±1.12%,比0. 01 mg/mL紅棗色素增加了19.86%,表明紅棗色素對亞油酸脂質過氧化具有一定的抑制作用,可作為一種天然抗氧化劑的來源。

圖3 紅棗色素對亞油酸脂質過氧化的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of jujube pigment on the linoleic acid lipid peroxidation

2.4 紅棗色素對Fe2+催化亞油酸脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素具有一定抑制Fe2+催化亞油酸脂質過氧化的作用(圖4),隨紅棗色素濃度增加,其抑制作用逐漸增強(p<0.05),且呈良好量效關系,但紅棗色素的抑制作用明顯弱于VC,0.10 mg/mL紅棗色素在第4 d的抑制率為43.57%±1.59%。黃酮類化合物對金屬離子(Fe2+)具有絡合作用[20],可間接抑制脂質過氧化反應,而紅棗色素富含黃酮類化合物,對Fe2+催化亞油酸脂質過氧化具有較好的抑制效果。

圖4 紅棗色素對Fe2+催化亞油酸脂質過氧化的抑制作用Fig.4 Inhibition effect of jujube pigment on the linoleic acid lipid peroxidation atalyzed by Fe2+

2.5 紅棗色素對小鼠肝組織自發性脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素對小鼠肝組織自發性脂質過氧化具有一定抑制作用(圖5),在0.25～2.0 mg/mL范圍內抑制作用較弱,超過2.0 mg/mL后,抑制作用隨色素濃度升高明顯增強(p<0.01),4.0 mg/mL時抑制率為34.90%±1.15%,較1.0 mg/mL時增加了25.10%,但抑制效果劣于VC。丙二醛(MDA)是脂質過氧化物的主要分解產物,其含量反映組織脂質過氧化程度,也間接反映組織受自由基攻擊的嚴重程度[21]。較高濃度紅棗色素對肝組織自發性脂質過氧化具有較強的抑制能力,表明紅棗色素能明顯抑制小鼠肝組織脂質過氧化而保護肝臟。

圖5 紅棗色素對小鼠肝組織 自發性脂質過氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition effect of jujube pigment on mice liver lipid peroxidation

2.6 紅棗色素對H2O2誘導小鼠肝組織脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素對H2O2誘導小鼠肝組織脂質過氧化具有較弱的抑制作用(圖6),隨紅棗色素濃度增加,抑制作用緩慢增強(p>0.05),4.0 mg/mL時抑制率為19.00%±2.00%,明顯低于VC(51.40%±1.22%)。H2O2具強氧化性,是有效的誘導劑,能刺激肝臟產生MDA,損傷細胞功能和結構[22],促發細胞衰老和死亡,而紅棗色素能抑制H2O2所致肝組織脂質過氧化的發生,對膜系統具有一定的保護作用。

圖6 紅棗色素對H2O2誘導小鼠肝 組織脂質過氧化的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of jujube pigment on mice liver lipid peroxidation induced by H2O2

2.7 紅棗色素對H2O2誘導紅細胞膜脂質過氧化的抑制作用

紅棗色素對H2O2誘導紅細胞膜脂質過氧化具有較強的抑制作用(圖7),且隨紅棗色素濃度增加抑制作用顯著增強(p<0.01),并呈明顯的量效關系。在0.4～1.2 mg/mL范圍內,紅棗色素的抑制效果劣于VC,但超過1.2 mg/mL時的抑制作用反而強于VC。2.0 mg/mL紅棗色素的抑制率為80.32%±1.53%,IC50為1.25 mg/mL,其抑制作用明顯強于VC(65.57%±1.69%,IC50為1.46 mg/mL)。生物體內的脂質過氧化主要發生在細胞膜上,而紅細胞脂質代謝的改變,將直接影響其結構和功能,可引起人體衰老和心臟病、動脈粥樣硬化、癌化、炎癥、糖尿病等嚴重疾病[23],紅棗色素可有效抑制膜質的過氧化和細胞損傷,具有良好的紅細胞保護作用。

圖7 紅棗色素對H2O2誘導 紅細胞膜脂質過氧化的抑制作用Fig.7 Inhibition effect of jujube pigment on erythrocyte membrane lipid peroxidation induced by H2O2

2.8 紅棗色素對H2O2誘導紅細胞溶血的抑制作用

紅棗色素對H2O2誘導紅細胞溶血具有較強的抑制作用(圖8),其抑制作用隨紅棗色素濃度升高逐漸增強(p<0.05),且呈良好的量效關系,2.0 mg/mL紅棗色素的抑制率達72.02%±1.70%,IC50為0.82 mg/mL,但抑制效果明顯弱于VC(89.24%±2.25%,IC50為0.47 mg/mL)。H2O2可引發氧化作用導致紅細胞損傷,使血紅蛋白逸出[24],由此可見紅棗色素能顯著抑制紅細胞溶血的發生,避免氧化損傷。

圖8 紅棗色素對H2O2誘導紅細胞溶血的抑制作用Fig.8 Inhibition effect of jujube pigment on erythrocyte hemolysis induced by H2O2

3 結論

紅棗色素具有一定的抗脂質過氧化能力,抑制能力隨紅棗色素濃度的升高而增強,且呈現良好的量效關系。紅棗色素對大豆油脂質過氧化有很好的抑制作用,其IC50為0.96 mg/mL;對Fe2+誘發卵黃脂蛋白、亞油酸及Fe2+催化亞油酸脂質過氧化均具有較好的抑制作用;對小鼠肝組織自發性脂質過氧化有一定的抑制能力,但對H2O2誘導小鼠肝組織脂質過氧化的抑制能力相對較弱;紅棗色素能顯著抑制H2O2誘導紅細胞膜脂質過氧化及H2O2誘導紅細胞溶血,在2.0 mg/mL濃度下的抑制率分別為80.32%±1.53%和72.02%±1.70%。綜上實驗結果證實,紅棗色素是很好的預防性抗氧化劑,可有效抑制脂質過氧化,其抑制程度也與濃度呈劑量關系。因此,應合理研究和開發具有預防衰老、心血管病、炎癥、腫瘤作用的紅棗色素抗氧化產品,這對以紅棗為原料的抗氧化功能食品具有重要的指導意義。

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