pH控制策略及pH反饋流加培養法 提高羅氏產堿桿菌的聚羥基丁酸產量

鄧志偉,王瑩瑩,張永杰,王松廷,楊生玉

(河南大學生命科學學院生物工程研究所,河南開封 475004)

伴隨科技的進步和全球人口的持續增長,塑料被廣泛用于日常生活及工業的各個方面。然而大部分的傳統塑料,如Polyethylene、Polypropylene、Polystyrene等都是不可降解的塑料，它們的使用給環境造成了嚴重的污染。為了減少白色污染問題,可降解的生物塑料應運而生。PHB具備較好的生物可降解性及塑料熱加工性,其分解產物能夠被環境中的微生物徹底利用,對自然界沒有任何污染。因此,PHB可以制成可降解垃圾袋、購物袋、一次性餐盒等,從而減少各種各樣的廢棄塑料對環境造成的嚴重污染。

聚羥基丁酸(PHB)是一種胞內存儲的生物可降解材料,是微生物在培養基中碳源和氮源比例失衡的條件下而產生的,作為碳源和能源而儲存于細胞內的物質[1]。PHB是微生物菌體同化作用的初級代謝產物,它可以維持滲透壓的平衡,與動物細胞和植物細胞中的糖元及淀粉一樣,是微生物內的儲能物質[2-3]。在自然條件下細菌菌體內PHB含量比較低,一般為1%～3%。但在培養基中碳源含量過量并且氮源缺乏的情況下,細菌菌體內的PHB含量可以達到菌體生物量的70%～80%,因此通過控制發酵液中碳氮的比例來調節微生物菌體內PHB的產量,同時這也給分批流加一定的碳源來提高PHB的產量提供了理論基礎。

國外關于PHB的探究起步較早,自20世紀70年代后,由于石油危機和環保運動,PHB的商業化生產受到許多科研工作者的重視。其中英國帝國化學公司是最早實現PHB工廠化生產的企業,其生產的PHBV(3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物),命名為Biopol,此外,美國、日本、加拿大等國家也已經實現了PHB的小規模工業化生產[4-5]。Sathiyanarayanan等采用統計學方法優化BacillussubtilisMSBN 17菌株的發酵條件,發酵40 h后PHB含量達到19.08 g/L[6]。Moreno等分別采用搖瓶和生物反應器優化培養Bacillusmegaterium,其PHB含量分別增加48%和314%[7]。

盡管我國對PHB的研究起步較晚,但發展迅速[8]。魏國清等利用E.coli工程菌在5 L生物反應器中培養32 h,PHB濃度達到8.24 g/L,且PHB含量占細胞干重的84.6%[9]。但是胞內PHB的提取純化工藝繁瑣,造成它的成本大概為化學合成塑料的幾倍,甚至十幾倍,所以提高PHB的產量,減少生產成本成為國內外業界急需解決的難題。

采用分批補料培養的方法提高PHB的產量是近些年來研究的一個熱點。分批補料培養是介于分批培養及連續培養之間的一種發酵培養技術。同分批補料發酵相比,分批補料培養[5]可以有效的降低底物濃度從而消除底物抑制、降低發酵液的粘度、增大體系初始溶氧濃度來提高底物利用率,從而縮短發酵時間,提高生產效率[10-11]。但是在已報道的研究工作中,PHB的生產得率一般低于0.25[12]。許懿等[13]利用真養產堿桿菌H16菌株生產PHB,細胞干重達到16.1 g/L,PHB的質量濃度達到7.9 g/L。本文首先研究了不控制pH及控制pH時發酵過程中相關參數的變化情況對發酵結果的影響,接著研究了pH作為補料的控制信號,采用pH反饋的發酵工藝來提高羅氏產堿桿菌的生物量和PHB的產量以及生產得率的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌株Rochealcaligenessp PP25 由本實驗實從污水中分離獲得[14]；PHB標準品 色譜級,Sigma公司;甘油、(NH4)2SO4、MgSO4、Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、檸檬酸、NaOH、HCl、濃H2SO4均為分析純。

BIOTECH-5BG-7000A自動發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司;ZWY-2102恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;1515型高效液相色譜儀 美國Waters公司;5810R高速冷凍離心機 Eppendorf;GNP-9080隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 培養基

一級種子培養基(g/L):牛肉膏 30,蛋白胨 10,NaCl 5,瓊脂 20,pH7.5。

二級種子培養基(g/L):葡萄糖 10,酵母粉 2,CaCl20.1,NaCl 1,K2HPO40.5,Na2HPO4·12H2O 0.6,pH7.0。

發酵培養基(g/L):葡萄糖 20,酵母粉 10,CaCl20.12,K2HPO42,Na2HPO4·12H2O 10,MgSO40.5,檸檬酸鐵 0.1。

補料培養基(g/L):葡萄糖 400,酵母粉 100。

以上培養基在115 ℃下滅菌30 min。

1.3 培養方法

1.3.1 種子的培養 挑取斜面上的菌落接入一級種子培養基中,30 ℃、200 r/min培養24 h,然后吸取一級種子培養液以6%的接種量接入二級種子培養基中,30 ℃,200 r/min培養10 h,接著吸取二級種子培養液以6%的接種量接入發酵培養基中。

1.3.2 不控制pH分批培養 將培養10 h的二級種子培養液按6%的接種量接入5 L發酵罐(裝液量3 L)中,400 r/min、30 ℃發酵培養24 h,pH不進行控制。研究在pH不控制的狀態下的發酵過程。

1.3.3 控制不同pH的分批培養 不控制pH的分批發酵過程中,由于pH的降低,對菌體生長產生一定的抑制作用,因此在實驗過程中利用6 mol/L的HCl和6 mol/L的NaOH調節發酵過程中的pH,使得pH分別控制在6.2～6.4、6.7～6.9、7.2～7.4三個范圍,其他培養條件與1.3.2相同,考察了不同的pH范圍對發酵結果的影響。

1.3.4 pH反饋的補料分批培養 pH反饋補料前期先進行分批培養,轉速、溫度同1.3.2,前期pH通過流加酸堿控制在6.8。pH反饋補料控制階段,pH控制與補料關聯的參數設置為反向關聯,當pH>6.8時啟動補料,補料模式為加2 s、停10 s。隨著發酵過程中pH的降低,泵入6 mol/L的NaOH使發酵培養過程的pH保持在6.7～6.9范圍內。

1.4 指標的測定

1.4.1 菌體生物量的測定 取發酵液10 mL,于離心機中8000 r/min離心10 min,棄上清,60 ℃干燥至恒重,稱量[15]。

1.4.2 殘糖的測定 發酵液中殘糖的測定采用DNS法[16]。首先是標準曲線的繪制,分別取葡萄糖(mg/mL)0、0.2、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于25 mL比色管中,用蒸餾水補充至2 mL,加入DNS試劑1.5 mL,沸水浴加熱5 min,冷卻至室溫,用蒸餾水定容至25 mL,混勻在540 nm波長下測定吸光度。將發酵液中的殘糖進行稀釋,糖濃度在0.1-1.2 mg/mL,取稀釋后的發酵液1.0 mL于25 mL比色管中,加入DNS試劑1.5 mL,沸水加熱5 min,冷卻至室溫后定容至25 mL,在540 nm波長下測定吸光度,從標準曲線查出葡萄糖濃度,求出發酵液中殘糖的含量。DNS標準曲線方程為Y=0.3995X-0.0307,R2=0.9996,其中X為葡萄糖濃度(mg/mL),Y為吸光值。

1.4.3 PHB濃度的測定 PHB含量測定采用高效液相色譜法[17]。精確稱量PHB樣品200 mg,放到比色管中,用硫酸進行消化處理,以超純水稀釋1000倍,然后使用0.45 μm的微孔濾膜過濾備用,最后用高效液相色譜法進行檢測。精確稱量200 mg PHB的標準品,放到比色管中,加入5 mmol/L硫酸溶液進行處理,用超純水分別稀釋為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的PHB溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,橫坐標是PHB的濃度,縱坐標是峰面積。PHB的標準曲線方程為:Y=211096.5X-47170.5,R2=0.99946。X是PHB的濃度,mg/L,Y是峰面積。色譜柱:BioRad公司Aminex HPX-87H柱,(300 mm x 7.8 mm,9 μm);柱溫:50 ℃;流動相:5 mmol/L硫酸溶液;初始流速:0.5 mL/min,進樣量20 μL,紫外檢測器波長210 nm。

1.5 數據處理

實驗數據采用Origin 8.0進行作圖和分析。

2 結果與討論

2.1 分批培養

2.1.1 不控制pH的分批發酵過程 葡萄糖經糖酵解途徑形成丙酮酸進而形成乙酰輔酶A,乙酰輔酶A在β-酮硫解酶、乙酰乙酰輔酶A、PHB合成酶等酶類的作用下合成PHB,因此在該過程下會受到pH的影響,所以在室驗中我們首先研究了不控制pH時發酵過程的各種參數對PHB分批發酵結果的影響,結果見圖1。從圖1中我們可以看出隨著發酵時間的增加,在發酵28 h時底物接近于消耗完全,PHB的濃度達到最高,PHB的濃度最大達到3.97 g/L。而此時發酵液的pH也從最初的7迅速降到了最低值,再隨著發酵時間的增加,底物的消耗速率迅速下降,同時產物PHB的產量開始下降，說明不控制pH的條件下發酵液的pH迅速下降,并且相對酸性條件下不利于產物的產生和儲存。在發酵24 h時菌體生物量達到最大6.55 g/L,然而隨著pH的下降,菌體的干重并未發生太大的變化,說明發酵過程pH的波動對菌體的生長影響較小。然而pH的波動對產物PHB的產量具有一定的影響,而且隨著碳源的耗盡,PHB也可以作為能源物質被利用,因此為了防止PHB在碳源耗盡時被菌體利用,選擇pH上升點(發酵28 h)作為發酵終點,同時該點也可作為補料點,補充一定量的碳源和控制發酵過程的pH來防止產物PHB濃度的下降。

圖1 在分批培養過程中相關參數的 時間曲線(pH不進行控制)Fig.1 Time course of correlation parameter during the batch culture (pH-uncontrolled batch culture)

2.1.2 控制pH的分批培養 PHB的生產過程是由酶一步步催化獲得,不同的pH對酶的活性以及菌體的生長具有一定的影響,根據我們的實驗室前期工作(數據未展示),選擇了將pH控制在6.2～6.4、6.7～6.9、7.2～7.4三個范圍來研究pH控制對PHB分批發酵結果的影響,結果見圖2。由圖2可得,與不控制pH的分批發酵相比,當pH控制在6.2～6.4時,菌體生物量及pH的產量分別提高了7.63%和3.63%;當pH控制在6.7～6.9時,菌體生物量及pH的產量分別提高了18.63%和12.52%;當pH控制在7.2～7.4時,菌體生物量及PHB濃度分別降低了24.76%和31.71%。由此圖和以上數據可以看出當pH控制在6.7～6.9的范圍時,不僅利于菌體自身的生長而且有利于PHB的合成,說明在pH為6.7～6.9的范圍下有關菌體生長和PHB合成的酶處于較高的活性狀態下,因此選擇將發酵過程的pH控制在6.7～6.9。

圖2 在分批培養過程中相關參數的時間曲線(pH進行控制)Fig.2 Time course of correlation parameter during the batch culture(pH-controlled batch culture)注:A：pH為6.2～6.4;B：pH為6.7～6.9;C：pH為7.2～7.4。

2.2 pH反饋補料分批培養

利用酸堿來調節pH的分批培養,可以使發酵過程中pH保持在一個相對較穩定的范圍,從而使得菌體和產物的形成都優于pH不控制的分批發酵培養過程。但由于發酵培養(pH控制在6.7～6.9)進行到8～12 h之后,發酵培養基中的葡萄糖基本耗盡,進而在之后的發酵過程中菌體生物量的形成緩慢增加,同時產物PHB會被當成碳源利用,使得產物的產量下降。因此為了提高菌體生物量及PHB的產量,實驗中選擇在發酵8 h后進行補料,并同時對補料的流加方式進行了優化。

2.2.1 流加模式優化 在pH控制與補料相關聯的補料分批培養過程中,通過反向關聯的方式,以pH為信號來流加葡萄糖和酵母浸粉混合液,即當pH大于6.9時啟動補料,反之停止補料。流加的碳氮混合液的量與控制模式有關。不同流加模式發酵過程的相關參數的影響結果見圖3。

圖3 pH反饋補料分批培養過程中相關參數的變化曲線Fig.3 Time course of correlation parameter during pH feedback fed batch culture

補料前的培養過程,通過流加酸堿使pH保持在6.7～6.9的范圍內。圖3A流加模式為加2 s，停10 s,補料分批培養過程中,在發酵開始階段,發酵液的pH降低,蠕動泵自動加入2 mol/L的NaOH溶液使發酵過程中的pH維持在6.7～6.9,當葡萄糖消耗殆盡之后由于氨基酸的脫氨基作用使pH增加,當pH高于6.9時,補料泵自動加入葡萄糖和酵母浸粉混合溶液;圖3B流加模式為加2 s、停20 s,pH控制范圍為6.7～6.9的pH反饋補料分批培養過程。2種補料模式的分批補料培養過程的實驗結果見表1。

表1 2種補料分批培養過程的實驗結果Table 1 The experiment results in the two kinds of fed-batch culture

注:A、B表示不同的補料分批培養過程。

圖3和表1的結果表明,pH反饋控制流加模式的變化對補料過程有明顯的影響。圖3、表1中的A流加模式,由于葡萄糖和酵母浸粉混合液的流加速度過快,導致發酵液中的葡萄糖質量濃度快速上升。過高的葡萄糖質量濃度抑制菌體的生長,最終延長了發酵的周期。B流加模式為葡萄糖的分解利用提供足夠的時間,使發酵液的pH能夠在6.87～6.92范圍內波動,從而避免了因為補料過快造成的葡萄糖濃度快速增加,抑制菌體生長現象的發生,延長了菌體的對數生長期,提高了菌體生物量及PHB的產量。由圖3可得,B流加模式發酵48 h即可使菌體生物量及PHB的產量達到最大，分別為22.14和14.41 g/L,而A流加模式發酵64 h才能使菌體生物量及PHB濃度達到最大,分別為19.69和13.717 g/L。與A流加模式相比，B的流加模式不僅可以縮短發酵時間,減少生產成本,同時菌體生物量及PHB濃度分別提高了12.44%和5.07%。

2.2.2 驗證實驗 按照上述優化后及優化前的流加模式進行重復實驗,發酵48 h,共做3個平行,結果見圖4。由圖4可得,優化后的補料模式比優化前的補料模式的菌體生物量及PHB濃度分別提高了35.5%和31.94%。

圖4 優化前后對比Fig.4 The comparison of before and after optimization

3 結論

本文利用羅氏產堿桿菌發酵生產PHB的過程中pH的變化情況,研究不同的pH范圍以及不同的pH反饋調節補料的流加方式對發酵結果的影響。通過不控制pH及控制pH的分批發酵過程中的菌體生物量、PHB濃度及殘糖的變化情況的研究得出,當pH不進行控制時發酵液的pH迅速下降到不利于菌體生產和產物產生的狀態。同時控制pH在不同范圍的研究表明，羅氏產堿桿菌在微酸性的條件下生長最快，且有利于PHB的合成。當pH控制在6.7～6.9時,菌體生物量及pH的產量比不控制pH時分別提高了18.63%和12.52%。

本文采用不同的pH反饋補料工藝,發酵生產PHB,最終得出最佳補料工藝參數為加2 s停20 s的模式,此時菌體生物量和PHB濃度分別為22.52 g/L和13.61 g/L，胞內的PHB含量達到60.44%。

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