響應面法優化木瓜蛋白酶嫩化牛肉工藝

周珠法

(浙江農業商貿職業學院烹飪旅游系,浙江紹興 312000)

牛肉富含人體必需的氨基酸和部分微量元素,是我國主要肉類食品之一。相比于豬肉而言,牛肉的蛋白質含量高,脂肪和膽固醇含量較低,營養價值豐富,深受廣大消費者的喜愛[1]。隨著我國居民消費水平的提高,牛肉在肉類消費總量中的比重逐年增加,同時消費者對牛肉品質也提出更高要求。嫩度是決定牛肉品質最重要的因素,也是消費者購買意愿的重要指標[2],所以嫩度的高低在一定程度上決定著牛肉的品質和價格,因此,如何提高牛肉嫩度成為改善牛肉品質的基礎。

近年來,許多學者一直致力于改善肉類嫩度的研究,并提出多種嫩化方法,如低溫吊掛、機械滾揉、電刺激、超聲波、鈣鹽注射、磷酸鹽處理、高壓處理、外源酶處理等[3-4]。在眾多方法中,外源酶嫩化法因具有操作簡單、不需要額外增加設備、基本不改變生產工藝、顯著提高牛肉嫩度等優點,而受到肉類研究者的重視[5-7]。木瓜蛋白酶是最常用的肉類嫩化外源酶,其酶活高、性質穩定、蛋白水解能力強、綠色安全,不僅可以提高肉的嫩度,改善肉的風味,而且不產生不良風味,因此廣泛應用于食品加工行業[8-9]。趙立等[10]以剪切力為評價指標,對木瓜蛋白酶嫩化鴨肉的工藝進行優化。肖夏等[11]以剪切力為評價指標,輔以質構特性,考察了復合酶(木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶)嫩化牛肉工藝,處理后牛肉剪切力顯著下降,質構特性較好保持。林志民等[12]以感官評價為評價指標,考察木瓜蛋白酶對牛肉嫩化的影響,發現酶濃度過大時會導致牛肉的過度嫩化,降低感官評價。李麗杰等[13]以剪切力為評價指標,輔以質構特性,研究木瓜蛋白酶法嫩化鹿肉工藝,嫩化后鹿肉剪切力值顯著降低(p<0.01),咀嚼力值與剪切力值存在正相關關系,彈性與剪切力不相關。夏軍軍等[14]以剪切力為評價指標,考察了木瓜蛋白酶嫩化牛腿肉工藝條件,在優化的條件下牛腿肉的剪切力與對照組相比顯著降低。目前牛肉嫩化工藝是以剪切力作為條件篩選的唯一或主要評價指標,以確定最優條件。然而,剪切力最低的條件下,牛肉感官評價、質構特性往往不是最佳的。牛肉嫩化最終目標還是為食用服務,過度追求剪切力的降低,反而會影響牛肉的食用品質。陶瑞等[15]研究發現,木瓜蛋白酶過大導致肉塊老化,水分流失,感官評價下降,但是剪切力卻升高。因此,嫩化工藝條件的確定有必要采用剪切力和感官評價雙指標來評價優化的效果,以確保較佳的食用品質。

表2 牛肉的感官評定標準Table 2 Standards of sensory evaluation of beef

本研究采用響應面優化法,以牛肉嫩化效果廣泛采用的剪切力測定和感官評價作為評價指標[16],考察木瓜蛋白酶對牛肉嫩化的影響,并對優化后的嫩化牛肉與對照組進行質構特性及系水性比較,最后進行初步嫩化機制研究,以期得到更加客觀、準確的評價結果,為改善外源蛋白酶在牛肉加工技術中的應用提供一定的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉 外脊,市售;木瓜蛋白酶 酶活10萬U/g，西安瑞盈生物科技有限公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 北京康普匯維科技有限公司;氯化鎂、氯化鉀 國藥集團工業股份有限公司;乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA) 山東佰仟化工有限公司;HE染色試劑盒 北京諾博萊德科技有限公司。

TA.XT Plus物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司;10001型電子天平 常州市宏衡電子儀器廠;HH-6型數顯恒溫水浴鍋 金壇市郎博儀器制造有限公司;控溫多用高速組織搗碎機 常州恒隆儀器有限公司;CTH1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘立科學儀器有限公司;UV1901紫外可見分光光度計 上海奧析科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛肉嫩化處理 精密稱取0.6 g木瓜蛋白酶,置于1 L pH7.0的磷酸鹽緩沖液中,攪均,4 ℃保存待用。

將牛肉剔除結締組織、淋巴及脂肪,順著肌纖維紋絡切成3 cm×3 cm×10 cm的肉塊,采用均勻注射法進行嫩化處理,每塊肉注射0.06%的木瓜蛋白酶20 mL,在50 ℃條件下處理2 h。

1.2.2 單因素實驗 固定pH7.0,處理溫度50 ℃,處理時間2 h,考察不同酶濃度(0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%)對牛肉剪切力和感官評價的影響;固定酶濃度0.08%,處理溫度50 ℃,處理時間2 h,考察不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對牛肉剪切力和感官評價的影響;固定酶濃度0.08%,pH6.5,處理時間2 h,考察不同處理溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對牛肉剪切力和感官評價的影響;固定酶濃度0.08%,pH6.5,處理溫度55 ℃,考察處理時間(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)對牛肉剪切力和感官評價的影響,實驗重復3次。進行單因素實驗,考察各因素對牛肉剪切力和感官評價的影響。

1.2.3 響應面優化實驗 以單因素實驗結果為依據,采用Box-Behnken中心組合實驗設計,對牛肉嫩化工藝進行響應面優化。實驗設計見表1,實驗重復3次。

表1 牛肉嫩化Box-Behnken設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design for beef tenderness

1.2.4 剪切力的測定 按NY/T 1180-2006[17]方法進行測定。

1.2.5 感官評價 參考GB/T 16291.1-2012[18]以及金慧玉[5]、韓東潔等[19]的評價方法。將嫩化處理后的牛肉切成1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm小塊,放入蒸煮袋中,在95 ℃水浴鍋中加熱至牛肉中心達到70 ℃,取出牛肉冷卻至室溫,牛肉品質從色澤、氣味、口感、外觀4個方面進行評價,選擇接受過專業訓練的10名食品人士組成感官評定小組,根據牛肉感官質量評分標準(表2)給予評分,計算平均值。

1.2.6 烹飪失水率和持水率的測定 按響應面優化條件對牛肉進行嫩化處理,同時以不加木瓜蛋白酶,其他條件同嫩化處理的牛肉作為對照組,按1.2.5中煮制條件進行煮制,用濾紙擦干牛肉表面水分,按照孟祥忍等[20]的方法測定失水率和持水率。

1.2.7 質構特性分析 按照羅亞蘭等[21]的測定方法對響應面優化條件嫩化處理和未加木瓜蛋白酶嫩化處理的對照組牛肉進行質構特性分析,測試條件:采用TPA模式,探頭型號:P/50;下行速度:4 mm/s;測試速度:5 mm/s;返回速度:5 mm/s;壓縮樣品高度為50%;時間:5 s;觸發力:5 g。測試項目有硬度、彈性、咀嚼性和內聚力。

1.2.8 肌原纖維小片化指數(MFI值)測定 按武軍等[22]的測定方法對1.2.7中優化處理組和對照組牛肉進行測定。

1.2.9 肌纖維密度和肌纖維直徑的測定 參考Olson D[23]及王海麗等的實驗方法[24],將1.2.7中優化處理組和對照組牛肉,順肌纖維方向切成3 cm×2 cm×1 cm的組織塊,固定在4%甲醛溶液中,石蠟包埋,常規切片,厚度4～6 μm,然后使用木精-伊紅染液染色10 min,水洗至無色,中心樹脂封固,每個樣品制3片標本備用,用顯微觀察,并用顯微圖像分析儀測定以下項目:

肌纖維密度:在10×10倍光鏡下隨機選10個視野,統計視野中肌纖維根數,換算得到1 mm2的纖維數目;

肌纖維直徑:在10×40倍光鏡下隨機測量100根肌纖維的直徑,其平均值即為肌纖維直徑。

1.2.10 數據分析 實驗數據以平均值±標準差表示,采用Orign 8.0、SPSS 19.0及Design-Expert 8.0軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 酶濃度對牛肉嫩化的影響 由圖1可以看出,隨著木瓜蛋白酶濃度的增加,牛肉的剪切力逐漸降低,而感官評價卻表現為先增加后降低的趨勢。當酶濃度為0.08%時,剪切力為27.27 N,感官評價達到最高,為74.30分;當酶濃度為0.14%時,剪切力最低,為19.31 N,感官評價為65.60分。這是因為酶濃度增加,反應速度也加快,單位時間內牛肉中肌原纖維的降解程度也相應增加,剪切力就越低,但是當酶濃度過大時(超過0.08%),牛肉中蛋白會因過度降解而失去食用價值[15],感官評價也開始降低。

圖1 酶濃度對剪切力和感官評價的影響Fig.1 The influence of enzyme concentration on shear force and sensory evaluation

2.1.2 pH對牛肉嫩化的影響 由圖2可以看出,隨著pH的增加,牛肉的剪切力呈現先快速下降而后緩慢增加的趨勢,而感官評價呈先增后降的趨勢。當pH為6.5時,剪切力最低,為25.23 N,而感官評價最高,為78.10分。這可能是因為pH6.5為木瓜蛋白酶的最適pH,此時木瓜蛋白酶處于最佳構象狀態,有利于酶解反應的進行[24]。

圖2 pH對剪切力和感官評價的影響Fig.2 The influence of pH on shear force and sensory evaluation

2.1.3 處理溫度對牛肉嫩化的影響 由圖3可以看出,不同溫度條件下,剪切力和感官評價呈現和pH類似的變化趨勢,當溫度為55 ℃時,剪切力最低,為20.78 N,而感官評價最高,為79.40分。這是因為隨著溫度升高,酶活增加,剪切力下降,感官評價增加;當溫度過高,部分木瓜蛋白酶發生變性失活,導致剪切力增加,牛肉也由于部分蛋白質變性而老化,感官評價下降[11]。

圖3 處理溫度對剪切力和感官評價的影響Fig.3 The influence of treatment temperature on shear force and sensory evaluation

2.1.4 處理時間對牛肉嫩化的影響 由圖4可以看出,隨著處理時間的增加,剪切力和感官評價變化趨勢與酶濃度類似,當處理時間為2 h時,剪切力為22.82 N,感官評價達到最高,為81.30分;當處理時間為3.5 h時,剪切力最低,為6.13 N,感官評價為67.20分。處理時間過短,牛肉嫩化不夠,處理時間過長,牛肉的完整性又會被破壞,導致感官評價降低[14]。綜上所述,選擇酶濃度0.08%、pH6.5、處理溫度55 ℃,處理時間2.0 h較為合適。

圖4 處理時間對剪切力和感官評價的影響Fig.4 The influence of treatment time on shear force and sensory evaluation

2.2 響應面優化實驗

2.2.1 響應面實驗設計與結果 單因素實驗結果可以看出:剪切力和感官評價的變化趨勢不完全相關。當剪切力最低時,感官評價并不是最高的;但是感官評價最高時,剪切力均較低,因此,采用感官評價為響應值進行響應面優化,實驗結果見表3。

表3 牛肉嫩化的Box-Behnken實驗結果Table 3 The results of Box-Behnken experiment for beef tenderness

2.2.2 模型的建立及方差分析 應用Design Export 8.0軟件對響應值和各因素進行回歸擬合,得到木瓜蛋白酶嫩化牛肉工藝中感官評價(Y)與酶濃度(A)、pH(B)、處理溫度(C)、處理時間(D)這4個因素之間的二次回歸方程:

Y=-773.28333+6649.58333A+250.08333B-9.56500C+26.18333D-295.00000AB-40.50000AC+372.50000AD+2.29000BC+7.70000BD-0.57000CD-21406.25000A2-27.60000B2-9.00000E-003C2-19.05000D2

以感官評價為響應值,根據表3實驗結果,應用Design Export 8.0軟件對牛肉嫩化工藝的模型進行回歸分析,結果見表4。

從表4可以看出,回歸模型p<0.0001,說明構建的模型極顯著。失擬項p>0.05,失擬不顯著,說明該方程可以很好的描述各嫩化條件和牛肉感官評價的關系。該模型決定系數R2=0.9645,表明該模型可以解釋響應面中96.45%的可變性,可以用于牛肉嫩化的優化。根據F值大小可知,影響感官評價因素的主次順序為:pH(B)>酶濃度(A)>處理時間(D)>處理溫度(C),其中一次項中因素A、B對感官評價影響極顯著(p<0.01),交互項中AC、BC、AD對感官評價影響極顯著(p<0.01),AB對感官評價影響顯著(p<0.05),平方項中A2、B2、D2對感官評價影響極顯著(p<0.01)。

2.2.3 響應曲面及等高線分析結果 對構建的回歸模型進行響應面分析,考察了各因素間交互作用與響應值之間的響應曲面圖,結果見圖5。從圖5可以看出:等高線的中心區域,感官評價最高,由中心向邊緣逐漸降低,這和陶瑞等[15]的研究結果一致。pH與處理溫度的響應曲面最為陡峭,說明兩者之間交互作用對感官評價的影響最為顯著,固定處理溫度或pH,感官評價和另一個因素呈非線性增長,說明二者交互作用極顯著,這和夏軍軍等[14]的研究結果相同,酶濃度與處理時間及處理溫度之間關系也類似于pH與處理溫度。酶濃度與pH之間的交互曲面較為陡峭,等高線呈橢圓,固定酶濃度或pH,感官評價隨著另一因素的升高呈先升高后下降的趨勢,且變化較為明顯,這表明二者交互作用顯著,這與表4中回歸分析結果是一致的。

表4 牛肉嫩化二次多項式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model for beef tenderness

圖5 各因素交互效應對感官評價的響應面圖Fig.5 Response surface curve of sensory evaluation affected by two-factor interactions

注:**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。

表5 優化前后牛肉的品質變化Table 5 Quality changes of beef before and after optimization

注:與對照組比較,**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05);表6同。對回歸方程進行偏導求解,得出感官評價最高,即牛肉嫩化的最佳條件為:酶濃度0.07%,pH6.92,處理溫度60.00 ℃,處理時間1.84 h,此時感官評價的預測值達到最大,為94.70分。

2.2.4 驗證實驗 為檢驗實驗的可靠性,同時方便實驗操作,采用酶濃度0.07%,pH6.9,處理溫度60 ℃,處理時間1.8 h進行3次驗證實驗,對優化前后牛肉的品質指標進行比較,實驗結果見表5。從表5可以看出,優化前后持水率、烹飪失水率、剪切力、感官評價、硬度、彈性、內聚性、咀嚼性均有極顯著差異(p<0.01),優化后感官評價達到94.20分,與模型預測值(94.70分)接近,較對照組提高了39.56%,持水率、彈性、內聚性及咀嚼性較對照組分別提高了28.41%、18.10%、7.31%和16.46%,而烹飪失水率、剪切力和硬度分別較對照組降低了28.50%、54.50%和14.46%。張婷等[25]采用酶解、超聲波輔助酶解、微波輔助酶解等嫩化工藝處理牛肉,發現實驗組的剪切力、硬度、咀嚼性較對照組顯著降低(p<0.05),彈性、回復性無顯著差異(p>0.05)。明建等[26]研究了蛋白酶嫩化處理牛肉后對其物性的影響,發現不同蛋白酶處理后持水力較對照組顯著提高,而失水率、剪切力、咀嚼性、彈性等指標較對照組顯著降低。本研究結果與張婷及明建有相同之處,但是對于咀嚼性、彈性、回復力也有一些差異,造成這些結果差異可能與牛肉的品種及部位、酶的純度及活性、肉樣本身品質、處理條件等因素有關。可以看出,優化后的牛肉食用品質顯著提高,證明該模型可以用于很好的描述牛肉嫩化工藝。

2.3 木瓜蛋白酶嫩化牛肉的肌纖維結構及小片化變化

肌纖維是構成肌肉的基本單位,其密度越大、直徑越小表明牛肉的肉質越嫩;而肌原纖維小片化指數(MFI 值)是衡量肌原纖維分解程度的指標,其值越大表明內部結構破壞越多。木瓜蛋白酶嫩化牛肉肌纖維結構及MFI值如表6所示。

表6 木瓜蛋白酶嫩化牛肉肌纖維結構及MFI值Table 6 Effect of the papain on the characteristics of beef myofibrils and MFI values

由表6可以看出,使用木瓜蛋白酶對牛肉進行處理,可以極顯著(p<0.01)增加牛肉的肌纖維密度及MFI值,并降低肌纖維直徑,這與施帥等[8]的研究結果一致。優化后MFI值和肌纖維密度分別增加74.93%和20.96%,而肌纖維直徑降低29.89%。這可能是因為木瓜蛋白酶處理可以催化部分肌纖維的蛋白質降解成較小的蛋白分子或多肽段,促進了肌纖維的小片化及肌纖維直徑的減小,肌纖維密度相應增加。

3 結論

本研究采用單因素實驗和響應面法對木瓜蛋白酶嫩化牛肉的工藝進行優化。得到的響應面模型效果極顯著(p<0.0001),得到最佳工藝條件為:酶濃度0.07%,pH6.9,處理溫度60 ℃,處理時間1.8 h。通過實驗驗證,牛肉的食用品質在優化后顯著提高(p<0.01),其感官評價為94.20分,較對照組提高了39.56%,而剪切力為21.49 N,較對照組降低了54.50%?？梢?本研究構建的模型準確可靠,與實驗擬合良好。初步機理研究發現木瓜蛋白酶可以促進牛肉肌纖維的小片化,使牛肉肌纖維直徑減小,密度增加,從而使牛肉嫩度提高。本研究使其牛肉食用品質得到顯著提高,為其生產加工提供一定的理論依據。

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