菌酶協(xié)同下的低溫壓榨菜籽粕 抗氧化肽制備工藝研究

葉國(guó)棟,潘婉蓮,柯 婉,余海忠

(湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院,湖北襄陽(yáng) 441053)

我國(guó)油菜籽產(chǎn)量居世界首位,每年的制油副產(chǎn)物——菜籽粕多達(dá)600～700萬(wàn)噸,其中含35%～45%的粗蛋白[1],還含有硫甙、單寧、植酸等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[2],因此,物理、化學(xué)、生物學(xué)等脫毒方法[3]被用于去除這些有害物質(zhì)。菜籽多肽,則是菜籽粕粗蛋白水解之后的多肽混合物,具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓和促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)等活性,相較粗蛋白它具有更優(yōu)的溶解性、凝膠性、吸水性等加工特性[4],可用于營(yíng)養(yǎng)飲品、酸性飲料和高蛋白食品的生產(chǎn)。

目前,關(guān)于抗氧化多肽的制備工藝,國(guó)內(nèi)外開展了一些研究。Wendee[5]用酶膜反應(yīng)器連續(xù)生產(chǎn)大豆多肽,由于它能及時(shí)分離酶解生產(chǎn)的多肽并且除去了產(chǎn)物反饋干擾,從而使得酶解效率得到提高。雷鳴[6]以FRAP法測(cè)定的大豆多肽總抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo),獲得最佳木瓜蛋白酶水解條件:溫度50 ℃,pH7.0,底物濃度5%,加酶量4%,水解時(shí)間4 h。武萬(wàn)興[7]固態(tài)發(fā)酵制備核桃粕多肽,篩選出枯草芽孢桿菌為最佳菌株,且發(fā)現(xiàn)分子量小于5000 Da的多肽抗氧化活性最強(qiáng)。郭濤[8]用中性蛋白酶AS1.398水解菜籽蛋白,確定了溫度45 ℃,pH7.2,酶解時(shí)間2 h、加酶量5%的最佳酶解條件,約有75%的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化為可溶性肽。劉大川[9]發(fā)明了一套菜籽粕直接酶水解制備菜籽多肽的工藝,縮短了工藝過程,降低了生產(chǎn)成本。何榮[10]利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽多肽,獲得最佳工藝條件:葡萄糖濃度0.26%,料液比1∶2.35 (W/V),培養(yǎng)基初始pH6.5,KH2PO4濃度0.26%,發(fā)酵溫度31.2 ℃,接種量3.37×107個(gè)/mL,時(shí)間100 h。姚曉紅[11]用枯草芽孢桿菌和酶共同發(fā)酵處理菜籽粕,使得多肽含量提高幾倍,且硫甙降解率較高。

盡管已有菌酶協(xié)同制備菜籽多肽的相關(guān)研究,但尚未見以組合菌種與堿性蛋白酶共同作用、液體發(fā)酵制備抗氧化菜籽多肽的報(bào)道。為此,本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵菌種組合、菌酶比、接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH、轉(zhuǎn)速等參數(shù)為考察指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法優(yōu)化,以獲取最優(yōu)的菜籽抗氧化多肽制備工藝,并對(duì)最優(yōu)工藝條件下制備的菜籽多肽抗氧化能力進(jìn)行考察,以期能為菜籽粕的綜合開發(fā)利用、產(chǎn)品附加值的提高提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽粕 干燥、粉碎,過50目篩,密封后置-20 ℃保存待用,湖北奧星糧油工業(yè)有限公司;枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、黑曲霉、米曲霉、堿性蛋白酶(≥20萬(wàn)U/g) 北京科博匯智生物科技(發(fā)展)有限公司;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,瓊脂15.0～25.0 g,自來水1000 mL,pH7.4～7.6)、PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂15.0～20.0 g,自來水1000 mL,自然PH)、PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,自來水1000 mL,自然PH) 實(shí)驗(yàn)室自配;無(wú)水乙醇、Tris堿、鄰苯三酚、HCl、鐵氰化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、三氯乙酸、醋酸、正丁醇、氨水、NaOH、CuSO4、生育酚等 上海國(guó)藥集團(tuán)公司;TBA、DPPH、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

FZ-102微型植物粉碎機(jī) 天津泰斯特設(shè)備公司;YSQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊設(shè)備公司;HZ-9211K恒溫振蕩器 常州恒隆儀器有限公司;DKB-501A超級(jí)恒溫水槽 上海精宏儀器公司;UV-2550型可見-紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;AL204電子分析天平 上海梅特勒公司;Finnpipette可調(diào)式微量移液器 Finnpipette公司;KQ-250DA超聲波清洗機(jī) 昆山超聲儀器公司;BCD-208K冰箱 青島海爾公司;GZX-9240MBE鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊設(shè)備公司;SIGMA 3K15低溫冷凍離心機(jī) Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株的活化與酶液的配制 枯草芽孢桿菌劃線轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,37 ℃活化培養(yǎng)12 h;釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉分別劃線轉(zhuǎn)接到PDA斜面上,28 ℃活化培養(yǎng)24 h。活化后的菌株分別用PDB培養(yǎng)基進(jìn)行150 r/min振蕩培養(yǎng),16 h后對(duì)菌液進(jìn)行無(wú)菌分裝,4 ℃保存,待用。此外,稱取一定質(zhì)量的堿性蛋白酶,按2.5%的比例(W/V=g/mL)加入無(wú)菌水,配制酶液,待用。

1.2.2 菜籽多肽的制備與含量測(cè)定

1.2.2.1 菜籽多肽的制備 稱取一定質(zhì)量的菜籽粕粉碎物,按一定的料液比(W/V=g/mL)加入無(wú)菌水,充分振蕩,置121 ℃濕熱滅菌30 min,待其冷卻至室溫后,將等體積混合的組合菌液按一定的菌酶比(V/V=mL/mL)與堿性蛋白酶液混合,得到菌酶混合液。最后,根據(jù)文獻(xiàn)[12],按10%的接種量(V/V=mL/mL)將混合液接種于菜籽粕,設(shè)置一定的pH和發(fā)酵溫度,150 r/min振蕩培養(yǎng),發(fā)酵一定的時(shí)間后取出,4 ℃ 5000 r/min離心20 min,取上清液,即得水溶性菜籽多肽[13]。

1.2.2.2 菜籽多肽含量的測(cè)定 參照魯偉等[14]的方法。首先,用5%的三氯乙酸依次配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取3 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與2 mL的雙縮脲試劑充分混勻,靜置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液于540 nm下測(cè)定OD值。以四肽的濃度為橫坐標(biāo)X,OD值為縱坐標(biāo)Y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=0.372X+0.0164,R2=0.998。然后,將上述制備的上清液全部轉(zhuǎn)進(jìn)25 mL容量瓶中,并用5%的三氯乙酸定容,搖勻。然后從中取3 mL溶液與2 mL的雙縮脲試劑充分混勻,靜置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液于540 nm下測(cè)定OD值,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得菜籽多肽濃度(mg/mL)。

1.2.3 菜籽多肽的抗氧化活性測(cè)定 工藝參數(shù)優(yōu)化階段的菜籽多肽抗氧化活性測(cè)定,采用鐵氰化鉀還原法[15]:取1 mL樣品溶液與2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)及2.5 mL 1.0%鐵氰化鉀溶液混合,50 ℃保溫20 min,加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻,靜置10 min于700 nm處測(cè)吸光值。以吸光值大小表示還原能力大小,測(cè)得的吸光值越大,表明菜籽多肽的還原能力也就越強(qiáng),即它的抗氧化活性就越大。

最優(yōu)發(fā)酵工藝下制備的菜籽多肽抗氧化活性測(cè)定,采用以下三種方法:

DPPH法[16]。取3.9 mL DPPH甲醇溶液(25 mg/L)于具塞試管中,與0.1 mL樣品甲醇溶液充分振蕩混合。暗處反應(yīng)30 min后,在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,空白管用甲醇溶液代替樣品溶液。清除率(%)=[(A0-A)/A0]×l00。其中,A0為空白吸光值,A為樣品吸光值。

抗脂質(zhì)過氧化法[15]。抗脂質(zhì)過氧化作用采用卵黃過氧化體系,在具塞試管中加入0.5 mL 10%的卵黃懸浮液和0.1 mL不同濃度樣品溶液,用蒸餾水補(bǔ)至1 mL,再加入1.5 mL 20%的醋酸溶液,1.5 mL 0.8% TBA溶液,振蕩混勻,加塞于95 ℃恒溫水浴中加熱60 min,流水冷卻至室溫,加入5.0 mL正丁醇,振蕩后,3000 r/min離心10 min,取上層清液,以正丁醇為空白管調(diào)零,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定532 nm處的吸光度A1。不加提取物的對(duì)照體系吸光度為A0,平行測(cè)定5次。按下式計(jì)算提取物對(duì)卵黃脂蛋白過氧化作用:清除率(%)=(A0-A1)/A0×100。

對(duì)獲得的水溶性菜籽多肽分別進(jìn)行0、10、100、1000倍的梯度稀釋,獲得供試樣品(濃度分別為0.7648、0.07648、0.007648、0.007648 mg/mL)同時(shí),配制相同梯度濃度的生育酚作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 菌種組合對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 取等體積的菌液相互混合進(jìn)行菌種組合,設(shè)置如下:Ⅰ-枯草芽孢桿菌;Ⅱ-釀酒酵母;Ⅲ-黑曲霉;Ⅳ-米曲霉;Ⅴ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母;Ⅵ-枯草芽孢桿菌、黑曲霉;Ⅶ-枯草芽孢桿菌、米曲霉;Ⅷ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉;Ⅸ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、米曲霉;Ⅹ-枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉;Ⅺ-枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉、米曲霉。設(shè)置菌酶比為1∶1,在自然pH、料液比為1∶15的條件下,分別接種上述組合菌種,150 r/min振蕩,30 ℃發(fā)酵24 h,測(cè)定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.2 菌酶比對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,分別按1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2的菌酶比,對(duì)菜籽粕進(jìn)行接種,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比為1∶15 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測(cè)定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.3 時(shí)間對(duì)菜籽粕多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比1∶15 (W/V)的條件下,發(fā)酵12、24、28、36、40、48、60、72 h,測(cè)定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.4 溫度對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,分別在溫度27、30、33、36、39 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比為1∶15 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測(cè)定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.5 pH對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,pH為6、7、8、9、10、11,料液比為1∶15 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測(cè)定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.4.6 料液比對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 以枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為菌株組合,設(shè)置菌酶比為1∶1,在溫度30 ℃,振蕩速率150 r/min,自然pH,料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (W/V)的條件下發(fā)酵24 h,測(cè)定菜籽多肽的抗氧化活性。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)用Design-expert軟件以發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、pH(C)、料液比(D)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),確定最優(yōu)組合,實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的因素水平表Table 1 The level table of factors of Box-Behnken central composite design

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro軟件(版本8.5)對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)及抗氧化活性測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理;響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用Design-expert軟件(版本8.0.6)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)菜籽多肽抗氧化能力的影響

2.1.1 菌種組合對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 不同菌種組合發(fā)酵對(duì)制備的菜籽多肽抗氧化活性影響見圖1。從圖1中可以看出,單株菌種發(fā)酵制備的菜籽多肽中,枯草芽孢桿菌和米曲霉的還原能力較強(qiáng),而釀酒酵母和黑曲霉則很弱。猜測(cè)這可能與釀酒酵母、黑曲霉單獨(dú)發(fā)酵時(shí)代謝產(chǎn)生的蛋白酶水解菜籽粕蛋白程度不夠、產(chǎn)生的肽鏈過長(zhǎng)有關(guān)。此外,當(dāng)使用Ⅹ菌種組合,即枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉,對(duì)菜籽粕進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí),制備的菜籽多肽還原能力最強(qiáng)。因此,確定枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉為最佳菌種組合。

圖1 不同菌種組合對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of different strains combination on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.2 菌酶比對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 按不同體積比混合組合菌種與堿性蛋白酶,接種菜籽粕后進(jìn)行液體發(fā)酵,考察其對(duì)制備的菜籽多肽抗氧化活性的影響。由圖2可知,在設(shè)置的菌酶比范圍內(nèi),菜籽多肽的還原能力呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),菌酶比為1∶1時(shí)抗氧化活性最強(qiáng)。因此,確定最佳菌酶比為1∶1。

圖2 不同菌酶比對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of different microorganism-enzyme ratio on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響見圖3。在設(shè)置的發(fā)酵時(shí)間范圍內(nèi),發(fā)酵36 h后菜籽多肽的還原能力最強(qiáng)。因此,選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為36 h。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 圖4顯示的是發(fā)酵溫度對(duì)菜籽多肽抗氧化性的影響。當(dāng)發(fā)酵溫度設(shè)置為36 ℃時(shí),菜籽多肽的還原能力最強(qiáng),因此,確定36 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.5 pH對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 pH對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響見圖5。由圖5可知,當(dāng)pH為7和8時(shí),二者對(duì)制備的菜籽多肽的還原能力影響效果差異不大。但考慮到堿性蛋白酶的活性pH范圍,所以選擇8作為最佳pH。

圖5 不同pH對(duì)菜籽多肽的抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of different pH on antioxidant activity of rapeseed peptides

2.1.6 料液比對(duì)菜籽多肽的抗氧化性的影響 菜籽粕粉碎物與無(wú)菌水按一定的質(zhì)量體積比進(jìn)行混合,接入菌酶后進(jìn)行液體發(fā)酵制備菜籽多肽。圖6顯示了不同的料液比對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響。由圖6可知,當(dāng)料液比在1∶20時(shí),制備的菜籽多肽還原能力最強(qiáng)。因此,確定1∶20為最佳料液比。

圖6 不同料液比對(duì)菜籽多肽的抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of different solid-liquid ratio on antioxidant activity of rapeseed peptides

表2 Box-Behnken中心組合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken center composite

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析Table 3 Variance analysis results

注:*:p<0.05,顯著;**:p<0.01,極顯著。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇菜籽多肽抗氧化性最強(qiáng)的因子:溫度(A)、時(shí)間(B)、pH(C)、料液比(D)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),分析各種因素間對(duì)菜籽多肽抗氧化性強(qiáng)弱的影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 方差分析 利用軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸比擬,得出菜籽多肽抗氧化活性(吸光值)對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比和pH的二次多項(xiàng)回歸方程為:抗氧化活性(吸光值)=1.00+0.052A+0.068B-0.056C+0.075D+0.058AB-0.012AC-0.073AD-0.014BC+8.500E-003BD-0.011CD+0.060A2-0.071B2-0.040C2+0.048D2。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。由表3可以看出,模型p=0.0216<0.05,說明此回歸模型顯著;而失擬誤差p=0.2483>0.05,說明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果不存在顯著差異；相關(guān)系數(shù)R2=0.912，說明91.2%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型解釋，和實(shí)際情況擬合程度較好。因此,可用于分析和預(yù)測(cè)抗氧化菜籽多肽的制備工藝條件研究。

圖7 兩因素間的交互效應(yīng)分析Fig.7 Surface figure analysis of interaction between two factors

根據(jù)各因素變量的顯著性檢驗(yàn),可以看出:D因素、B因素、C因素、A因素的p<0.05,說明料液比、發(fā)酵時(shí)間、pH、發(fā)酵溫度對(duì)響應(yīng)值吸光值的影響顯著。其中,料液比對(duì)響應(yīng)值(吸光值)的影響最大,發(fā)酵時(shí)間次之,pH則影響更小;而A因素的p>0.05,即發(fā)酵溫度的影響不顯著。各因素對(duì)菜籽多肽抗氧化活性影響的主次順序?yàn)?D>B>C>A。

2.2.3 兩因素間的交互效應(yīng)分析 本實(shí)驗(yàn)使用Design-Expert軟件分析因素間的交互效應(yīng)影響,在保持2個(gè)因素均為最優(yōu)條件下,來分析其它2個(gè)因素間的交互效應(yīng),它們與響應(yīng)值的關(guān)系用三維空間響應(yīng)面圖表示,具體見圖7。

圖7a顯示的是發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間對(duì)菜籽多肽抗氧化活性影響。隨著溫度和時(shí)間的增加,菜籽多肽的抗氧化性均逐漸升高,但當(dāng)它們?cè)黾拥揭欢ǔ潭葧r(shí),抗氧化性的增加趨勢(shì)平緩。圖7b顯示的是發(fā)酵溫度和pH對(duì)菜籽多肽抗氧化活性影響。當(dāng)固定pH在某一值時(shí),隨著溫度的升高,菜籽多肽抗氧化活性逐漸升高;當(dāng)固定發(fā)酵溫度在某一值時(shí),隨著pH的升高,菜籽多肽抗氧化活性先增加后減少。圖7c顯示的是發(fā)酵溫度和料液比對(duì)菜籽多肽抗氧化活性影響:在發(fā)酵溫度固定在某一值時(shí),隨著料液比的增大,菜籽多肽抗氧化活性逐漸減小;而固定料液比值,抗氧化性隨著發(fā)酵溫度的升高而增強(qiáng)。圖7d顯示的是發(fā)酵時(shí)間和pH對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響。當(dāng)固定發(fā)酵時(shí)間在某一定值時(shí),隨著pH的升高,菜籽多肽抗氧化活性逐漸減小;反之,固定pH時(shí),抗氧化活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。圖7e顯示的是發(fā)酵時(shí)間和料液比對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響。當(dāng)固定料液比在某一定值時(shí),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),菜籽多肽抗氧化活性逐漸升高。圖7f顯示的是pH和料液比對(duì)菜籽多肽抗氧化活性的影響。當(dāng)固定料液比在某一定值時(shí),隨著pH的升高,菜籽多肽抗氧化活性逐漸升高。

2.2.4 響應(yīng)面最佳條件選擇 利用軟件對(duì)菜籽多肽抗氧化活性響應(yīng)面的分析,得出最佳條件為:用枯草芽孢桿菌、黒曲霉、米曲霉為最佳菌種組合(V/V/V=1∶1∶1),菌酶比1∶1 (V/V),菌酶混合物的接種量為10%(V/V),發(fā)酵溫度為36.13 ℃、發(fā)酵時(shí)間為36.43 h、pH為8.32、料液比為1∶20.13 (W/V)。此時(shí),菜籽多肽的抗氧化活性最強(qiáng),吸光值為1.28。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值是否準(zhǔn)確,同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利,將優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)調(diào)整為:最佳菌種組合為枯草芽孢桿菌、黒曲霉、米曲霉為(V/V/V=1∶1∶1),菌酶比為1∶1 (V/V),接種量為10%(V/V),發(fā)酵溫度為36 ℃,發(fā)酵時(shí)間為36 h,pH為8,料液比為1∶20 (W/V),在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果測(cè)得的吸光值為1.26,與預(yù)測(cè)值相差0.02,非常接近。這證明由響應(yīng)面分析得到的實(shí)際值與二次多元回歸模型預(yù)測(cè)值吻合良好,因此,優(yōu)化后的菜籽多肽制備工藝有較高的可信度和實(shí)用價(jià)值。

2.4 最優(yōu)工藝條件下制備的菜籽多肽抗氧化性測(cè)試

對(duì)最優(yōu)工藝下制備的菜籽多肽含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果為0.7648 mg/mL,梯度稀釋后,分別測(cè)定其清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基以及抗脂質(zhì)過氧化能力,其抗氧化活性隨濃度的變化情況見圖8。由圖8可知,不同濃度的菜籽多肽對(duì)上述3種作用對(duì)象均具有較好的清除活性,在設(shè)置的最高濃度0.7648 mg/mL,對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到67.4%(圖8A),對(duì)DPPH自由基清除能力達(dá)到76.78%(圖8B),抗脂質(zhì)過氧化作用能力達(dá)到61.5%(圖8C)。其中,菜籽多肽對(duì)DPPH的抗氧化活性最強(qiáng),超氧陰離子次之,抗脂質(zhì)過氧化能力最低,最高濃度下3種抗氧化活性均低于陽(yáng)性對(duì)照生育酚,但是三者的清除率都超過了60%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步印證了本工藝所制備的菜籽多肽具有良好的抗氧化活性。

圖8 不同濃度的菜籽多肽清除自由基活性。Fig.8 Free radicals scavenging activity of different concentrations rapeseed peptides注:A:超氧陰離子;B:DPPH自由基;C:抗脂質(zhì)過氧化。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用液態(tài)發(fā)酵方法制備具有抗氧化活性的菜籽多肽,確定枯草芽孢桿菌、黒曲霉、米曲霉為最佳菌種組合(V/V/V=1∶1∶1),菌酶比為1∶1 (V/V),菌酶混合物的接種量為10%(V/V),在此條件下,接

種菜籽粕水溶液,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),得出最優(yōu)工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度為36 ℃,發(fā)酵時(shí)間為36 h,pH為8,料液比為1∶20 (W/V)。此時(shí),菜籽多肽的抗氧化活性(吸光值)達(dá)到1.26。通過三次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵參數(shù)準(zhǔn)確、可靠,具有實(shí)用價(jià)值。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)對(duì)最優(yōu)工藝下制備的菜籽多肽的抗氧化活性也進(jìn)行了測(cè)試,在設(shè)定的最大濃度0.7648 mg/mL處,菜籽多肽對(duì)超氧陰離子和DPPH自由基的清除率分別達(dá)到67.4%和76.78%,抗脂質(zhì)過氧化活性達(dá)到61.5%,結(jié)果進(jìn)一步印證了菜籽多肽具有良好的抗氧化能力。

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