培養條件和果汁種類 對脂環酸芽孢桿菌生長的影響

白 淼,張 燦,*,張明露,史 云,王莉莉,戚麗華

(1.中國人民解放軍疾病預防控制所,北京 100071;2.北京工商大學環境科學與工程系,北京 100048;3.中國人民解放軍陸軍總醫院,北京 100700)

脂環酸芽孢桿菌是造成巴氏滅菌果汁腐敗的重要細菌之一,具有嗜酸、耐熱、產芽孢等特征。脂環酸芽孢桿菌的芽孢具有很強的抗逆性,常用的果汁滅菌措施如巴氏滅菌難以將其有效滅活。1984年Cerny首次從腐敗果汁中分離出脂環酸芽孢桿菌[1],此后國內外有關脂環酸芽孢桿菌的研究逐年增多,目前已經受到果汁飲品行業的重點關注。脂環酸芽孢桿菌屬于非致病菌[2],但是其具有“煙熏味”和“藥味”的代謝產物愈創木酚和2,6-二溴苯酚,在極低濃度條件下就會嚴重影響果汁風味[3]。近年來,多個國家相繼發生脂環酸芽孢桿菌引發的巴氏滅菌果汁腐敗事件。Oteiza報道阿根廷采集到的果蔬汁樣品中,脂環酸芽孢桿菌陽性樣品檢出率為24%～100%[4]。加納和尼日利亞的225份果汁樣品中,有26份(11.6%)樣品脂環酸芽孢桿菌的檢測結果呈陽性[5]。從脂環酸芽孢桿菌污染途徑來看,土壤是其主要來源,生產果汁所用的原料果表面一旦被污染,在后續的生產環節中難以將其徹底去除,容易引發果汁腐敗[6]。

表1 培養基成分[8-9]Table 1 Ingredients of different media[8-9]

注:*微量元素溶液:CaCl2·2H2O 0.66 g/L,ZnSO4·7H2O 0.18 g/L,CuSO4·5H2O 0.16 g/L,MnSO4·4H2O 0.15 g/L,CoCl2·6H2O 0.18 g/L,H3BO30.10 g/L,NaMoO4·2H2O 0.30 g/L。

目前國內外還沒有確定脂環酸芽孢桿菌的標準培養基,培養條件也沒有統一規定。此外,脂環酸芽孢桿菌在不同種類果汁中的生長情況和代謝產物的釋放特征也不明確。本文研究pH以及不同種類的培養基和果汁對脂環酸芽孢桿菌生長的影響,旨在進一步優化脂環酸芽孢桿菌的檢測方法,為果汁中脂環酸芽孢桿菌污染的防控和果汁品質質量的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂環酸芽孢桿菌 從市售橙汁產品中分離得到,采用通用引物27F/1492R進行擴增,引物序列為27F:AGAGTTTGATYMTGGCTCAG;1492R:GGTTACC TTGTTACGACTT[7]，通過16S rDNA序列分析及BLAST比對,該菌與A.acidocaldariusATCC 43030的相似度達99%,確定分離菌株屬于Alicyclobacillus屬;菠蘿汁、橙汁、番茄汁、梨汁、蘋果-葡萄汁、蘋果汁、葡萄汁、桃汁和西柚汁 均為國產和進口的市售果汁產品,處于保質期內的100%純果汁,不含任何防腐劑;Yeast Starch Glucose(YSG)培養基、Bacillusacidoterrestristhermophilic(BAT)培養基、Alicyclobacillusacidoterrestrismedium(AAM)培養基、K氏培養基和SK培養基的成分見表1;馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(PDB)和營養肉湯培養基 購買自當地試劑公司;愈創木酚標準品 純度為99.9%,TRC公司,加拿大;2,6-二溴苯酚標準品 純度為99.9%,SUPELCO公司,美國。

7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀 Agilent公司,美國;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、萃取瓶和固相微萃取裝置 SUPELCO公司,美國;純水儀 Thermo公司,美國;數顯恒溫磁力攪拌器、超凈工作臺、臺式pH計、恒溫培養箱、恒溫搖床、渦旋振蕩器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂環酸芽孢桿菌計數 采用無菌生理鹽水將待測菌液按1∶10進行梯度稀釋,涂布于BAT固體培養基,置于42 ℃恒溫培養箱中培養4 d后計數。

1.2.2 愈創木酚和2,6-二溴苯酚的檢測 采用固相微萃取(SPME)和氣相色譜(GC)-質譜(MS)技術檢測果汁中脂環酸芽孢桿菌的代謝產物愈創木酚和2,6-二溴苯酚,具體方法參照文獻[10]。

1.2.3 pH對脂環酸芽孢桿菌生長的影響 將濃度為2.2×103CFU/mL的脂環酸芽孢桿菌新鮮菌液接種到pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的100 mL BAT液體培養基中,置于45 ℃恒溫水浴搖床中培養2 d后計數。

1.2.4 培養基種類對脂環酸芽孢桿菌生長的影響 將濃度為1.7×102CFU/mL的脂環酸芽孢桿菌新鮮菌液分別接種到100 mL的BAT培養基、YSG培養基、AAM培養基、K氏培養基、SK培養基、PDB培養基和營養肉湯培養基中,根據1.2.3的實驗結果確定培養基的pH為4.0,置于45 ℃恒溫水浴搖床中培養2 d后計數。

1.2.5 果汁種類對脂環酸芽孢桿菌生長的影響 將濃度為4.5×102CFU/mL的脂環酸芽孢桿菌新鮮菌液分別接種到100 mL的9種果汁中,分別為菠蘿汁(pH3.5)、橙汁(pH3.7)、番茄汁(pH4.3)、梨汁(pH3.3)、蘋果-葡萄汁(pH3.4)、蘋果汁(pH3.6)、葡萄汁(pH3.1)、桃汁(pH4.0)和西柚汁(pH3.0),置于45 ℃恒溫水浴搖床中培養20 d后,對果汁中脂環酸芽孢桿菌進行計數,并采用SPME-GC-MS檢測脂環酸芽孢桿菌代謝產物愈創木酚和2,6-二溴苯酚。

1.3 數據處理

使用SPSS 19.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 pH對脂環酸芽孢桿菌生長的影響

圖1為脂環酸芽孢桿菌在不同pH(BAT液體培養基)下的生長情況。結果表明脂環酸芽孢桿菌具有嗜酸性,在pH4.0時生長情況最好,細菌數量達到7.9×104CFU/mL。在強酸性(pH2.5)條件下生長較差,細菌數量為9.5×103CFU/mL,偏中性條件(pH6.0～7.0)下生長情況最差,細菌數量級僅在102CFU/mL左右。因此,脂環酸芽孢桿菌生長的pH應該控制在pH3.0～5.0之間,最好是pH4.0左右。脂環酸芽孢桿菌能夠在pH較低的環境下生存,可能與其細胞膜上特有的ω-環狀脂肪酸有關[11]。ω-環狀脂肪酸相當于一個保護層,能夠幫助它抵抗高溫和酸性的惡劣環境。袁亞宏等[12]對脂環酸芽孢桿菌的生長特性進行研究,發現其在pH2.0～7.0的范圍內均可生長,最適生長pH為4.0,這與本文的結果基本一致。

圖1 不同pH對脂環酸芽孢桿菌生長的影響Fig.1 Effects of pH on the growth characteristics of Alicyclobacillus

2.2 培養基種類對脂環酸芽孢桿菌生長的影響

由圖2可知,培養基種類對脂環酸芽孢桿菌的生長影響較大。其中脂環酸芽孢桿菌在AAM培養基和BAT培養基中生長情況最好,K氏培養基、SK培養基和YSG培養基次之,PDB培養基較差,營養肉湯培養基最差。脂環酸芽孢桿菌在AAM培養基中的數量達到3.1×105CFU/mL,在BAT培養基中略少,為1.8×105CFU/mL。脂環酸芽孢桿菌在營養肉湯培養基中生長緩慢(4.2×103CFU/mL),與AAM培養基和BAT培養基中的細菌數量相比,相差了兩個數量級。圖2表明,AAM培養基和BAT培養基與其他培養基相比,更適合用來培養脂環酸芽孢桿菌。目前用于培養脂環酸芽孢桿菌的培養基和培養條件尚未統一規定。Goto比較脂環酸芽孢桿菌在BAT培養基和YSG培養基上的生長情況,發現營養細胞沒有任何明顯區別,但芽孢在YSG培養基中的生長情況要明顯強于BAT培養基[13]。Walls報道脂環酸芽孢桿菌在K氏培養基上的生長情況要好于PDA培養基,這與本文的結果相同[14]。Chang認為相對于K氏培養基和PDA培養基來說,SK培養基更適合脂環酸芽孢桿菌的生長,效果由好到差依次是SK培養基>PDA培養基>K氏培養基[15]。Baumgart建議使用PDA培養基(pH3.5)培養脂環酸芽孢桿菌[16]。目前各個機構組織也給出了不同建議,如美國公共衛生協會(APHA)建議采用K氏培養基[17];日本果汁協會(JFJA)建議使用YSG培養基用于該菌的分離[18];國際果汁生產商聯合會(IFU)在2007年對果汁中脂環酸芽孢桿菌的相關檢測方法進行了重新修訂,建議將K氏培養基(pH3.7)與BAT培養基(pH4.0)或YSG培養基(pH3.7)結合使用[19]。

圖2 培養基種類對脂環酸芽孢桿菌生長的影響Fig.2 Effects of media on the growth characteristics of Alicyclobacillus

2.3 果汁種類對脂環酸芽孢桿菌生長及代謝產物的影響

圖3表明脂環酸芽孢桿菌在不同種類的果汁中生長差異明顯,在葡萄汁中的生長情況最好,細菌數量為1.5×104CFU/mL;其次是橙汁,細菌數量為8.5×103CFU/mL。在番茄汁、蘋果汁、蘋果-葡萄汁、桃汁和梨汁中的生長情況相近(103CFU/mL)。但是,在菠蘿汁和西柚汁中生長緩慢,細菌數量分別為4.4×102CFU/mL和1.9×102CFU/mL。Spllttstoesser[20]報道橙汁和梨汁最有利于脂環酸芽孢桿菌的生長,其次是蘋果汁、桃汁和白葡萄汁,柚子汁中生長最慢,這與本文的結果基本一致。果汁中的主要營養成分如礦質元素(鉀、鎂和鈣等)、蔗糖以及檸檬酸等會對脂環酸芽孢桿菌的生長產生一定影響。不同種類果汁中的各營養成分含量有所差別,這很可能是造成脂環酸芽孢桿菌在不同果汁中的生長產生明顯差異的原因之一。

圖3 果汁種類對脂環酸芽孢桿菌生長的影響 Fig.3 Effects of different juices on the growth characteristics of Alicyclobacillus

本研究同時檢測了果汁中脂環酸芽孢桿菌的代謝產物愈創木酚和2,6-二溴苯酚,結果見圖3。在未接種脂環酸芽孢桿菌的空白對照組中,9種果汁均未檢測出愈創木酚和2,6-二溴苯酚。接種脂環酸芽孢桿菌的9種果汁培養20 d后均未檢測出2,6-二溴苯酚;除葡萄汁外,其他8種果汁均檢測出愈創木酚(8.6～23.9 μg/L)。這表明脂環酸芽孢桿菌污染過的果汁,愈創木酚可能是影響果汁風味更常見的代謝產物。據前期報道[21],在24份市售果汁產品中愈創木酚檢出率為33.3%(8/24),濃度最高可達26.9 μg/L,而2,6-二溴苯酚檢出率為0%(0/24),這與本文的結果基本一致。

對果汁中脂環酸芽孢桿菌的數量和愈創木酚的濃度進行Pearson相關分析,結果表明r=-0.496,p=0.175>0.05，相關性不具有統計學意義,因此尚不能認為二者存在相關性。如圖3所示,葡萄汁中并未檢測出愈創木酚,但是細菌數量卻高達1.5×104CFU/mL;菠蘿汁中檢測出的愈創木酚濃度最高(23.9 μg/L),但是細菌數量卻僅有4.4×102CFU/mL,遠遠低于其他幾種果汁。據報道,果汁中愈創木酚的釋放量除了與脂環酸芽孢桿菌初始數量有關外,也與培養溫度、熱沖擊條件、果汁類型、頂部可利用空間、氧氣等多種因素相關[22]。此外,香草醛、香草酸和阿魏酸是微生物代謝產生愈創木酚的前體物質,它們在果汁中的含量也會影響愈創木酚的釋放。

3 結論

脂環酸芽孢桿菌在pH4.0時生長情況最好,7種常見培養基中AAM培養基和BAT培養基更適合用來培養該細菌。脂環酸芽孢桿菌在不同種類果汁中生長差異明顯,在葡萄汁和橙汁中的生長情況最好,菠蘿汁和西柚汁中較差。接種了脂環酸芽孢桿菌的9種果汁中均未檢測出2,6-二溴苯酚;除葡萄汁外,其他8種果汁中均檢測出愈創木酚,濃度范圍在8.6～23.9 μg/L之間。這說明脂環酸芽孢桿菌污染過的果汁中,較2,6-二溴苯酚而言,愈創木酚檢出率高,因此對果汁風味的影響更大。在今后的研究中,需要進一步完善和優化脂環酸芽孢桿菌的培養條件和方法,探索高效準確的檢測手段及控制方法,為提高果汁品質提供參考。

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