環介導恒溫擴增快速檢測植物油中 摻假地溝油方法的建立

趙彩紅,蔡 勇,曹 忻,楊具田,伍欣然,臧榮鑫,*,徐紅偉,*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030;2.西北民族大學實驗中心,甘肅蘭州 730030)

近年來,諸多不法企業將動物油脂或者地溝油按比例勾兌成食用植物油,從中謀取暴利。地溝油主要是由各種潲水、用于油炸食品的油、劣質動物肉、內臟、毛皮等加工及提煉后產出的油煉制而成。其色澤、氣味、滋味等感官指標,以及酸價和過氧化值等理化指標接近或完全符合國家《食用植物油衛生標準》(GB2716-2005),摻混后與正常食用植物油難以區分[1]。植物油中摻假地溝油,使得大量地溝油重回餐桌,危害人們的健康。因此,建立一種快速、高效、準確、適應性強的現場檢測方法具有重要的意義。

2011年中華人民共和國衛生部組織全國相關領域的專家、學者和技術人員開展了大規模的地溝油檢測技術的聯合攻關研究,先后征集和驗證的地溝油檢測方法達到300多種,包含光譜法、色譜法、核磁共振及電子鼻、電子舌等氣滋味譜方法。2012年初步確定了4個檢測方法以及3個篩查方法,其中含三種辣椒堿殘留量的液相色譜-質譜法[2-4]、特征奇數碳脂肪酸的多維氣相色譜-質譜法[5]、高場核磁共振法[6-8]等。但是由于地溝油來源及成分的復雜性和精煉工藝的差異性,迄今為止未得出任何公認的鑒別檢測方法,而篩選出的7種方法還需進一步驗證和完善,確定其有效性和準確性。地溝油在收集過程中會不可避免地混入動物源性成分,因此,新發展起來的分子生物學技術檢測地溝油的方法值得深究。

目前,分子生物學方法包括普通PCR法[9],單一熒光PCR法[10],多重熒光PCR法及實時熒光PCR[11-12]等。楊冬燕等利用多重實時熒光PCR法鑒別牛肉[13]、羊肉[14]的摻假,候東軍等[15]也利用三重熒光PCR技術鑒定食品中的牛、豬、鴨源性成分,王立平等[16]利用PCR法檢測食用植物油中動物源性成分,黃治國等[17]應用PCR技術檢測食用油中雞和牛源成分,探討了PCR技術在食用油中檢測動物源性成分的可行性。由 Notomi等[18]人發明的環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)克服了PCR技術的某些不足,針對靶基因的6個特異區域,設計4條特異性引物,具有特異靈敏、簡單易學等特征,尤其適合一些場所的快速檢測。譚貴良等[1]根據GenBank 數據庫中豬、牛、雞、鴨的線粒體基因序列設計了四組引物,首次采用LAMP方法對食用植物油和地溝油中的動物源性成分進行了檢測,但此方法需通過四次擴增反應,才僅能檢測四種動物源性DNA,不利于現場快速檢測。本研究依據脊椎動物線粒體基因組中的超級保守DNA序列[19]為靶標,以植物油中不應該存在動物源性成分為鑒定依據,以期建立一種能一次反應同時特異性擴增出牛、羊、豬和雞等所有脊椎動物源性DNA的現場快速檢測LAMP技術,為油脂的摻假鑒偽提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛油、羊油、豬油以及雞油 自制,從本地市場分別采購牛板油、羊板油、豬板油以及雞板油,切成約1 cm3熬制1 h左右,棄油渣,將油儲于陶瓷容器中,待冷卻凝固后室溫放置備用;陽性對照(豬質粒) 根據陳正芳[20]方法制備;大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和兩種不同品牌的植物調和油 購自本地超市;Bst DNA聚合酶、甜菜堿、dNTP、熒光染料SYBR Green I、SDS、Tris、NaCl、Na2EDTA、巰基乙醇、TE緩沖液等 購自寶生物工程(大連)有限公司。

超速低溫離心機 湘儀離心機儀器有限公司;超純水系統 購自德國;FTC-3000+實時熒光PCR儀 產自加拿大Funglyn Biotech。

1.2 實驗方法

1.2.1 LAMP引物設計 涂四利等[19]在比較所有細菌、古細菌及所有線粒體全基因組數據后,發現僅在脊椎動物的線粒體基因組有4段獨有的最長或次長的22～30 bp的超級保守子序列,經BLAST在線比對進行分析,這4段保守子序列集中在一段259 bp的保守序列中。本研究根據這段259 bp的保守序列為目標序列,利用引物設計網站http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.heml設計了兩對特異性引物,即兩條外引物(F3、B3)和兩條內引物(FIP、BIP)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,PAGE純化。引物序列見表1。

表1 LAMP反應引物 Table 1 Primer used in LAMP

1.2.2 基因組DNA的提取 采用SDS堿裂解法[21]提取植物油以及65 ℃水浴成液態后的動物油脂的總DNA。在2 mL離心管中加入400 μL TE(Tris-HCl)緩沖液,然后加入食用油1 mL,漩渦振蕩混勻約5 min,室溫下13000 r/min離心5 min,小心去除上層油脂,留下層水相,在同一支EP管中再次加入食用油1 mL,渦旋振蕩混勻,離心共重復20次后,轉移水相至另一新的EP管中,加入100 μL 20% SDS 混勻,65 ℃水浴10 min,期間顛倒數次。加入200 μL 3 mol/L NaAc,混勻,置于冰上20～30 min后,4 ℃、13000 r/min 離心10 min,取上清液至一新的EP管中,再加入等體積的Tris苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻,靜置10 min,離心。取上清液至一新的EP管中,加0.7倍體積的異丙醇,顛倒混勻后于-20 ℃冰箱靜置過夜沉淀DNA,再4 ℃ 13000 r/min離心10 min,去除上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,反復2次,自然晾干,加50 μL TE溶解,-20 ℃保存。

1.2.3 LAMP反應及反應體系的優化 LAMP反應體系(25 μL)含有1.2～2.4 μmol/L FIP、1.2～2.4 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8～1.6 mol/L 甜菜堿、4～10 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、8 U BstDNA聚合酶及2 μL DNA模板。反應條件為65 ℃,擴增1 h。以雙蒸水作為陰性對照。

LAMP擴增產物采用恒溫實時熒光法檢測以及加入SYBR Green I熒光染料,肉眼觀察反應結果。方法一:反應體系配制完成后加入0.2 mL的離心管,在體系中加入0.2 μmol/L的SYBR Green I熒光染料,并加入50 μL的穩定液以避免反應體系的揮發和污染。通過實時熒光PCR儀設定 Holding Stage為 65 ℃ 30 s,1 個循環;Cycling Stage為 65 ℃ 15 s,65 ℃ 45 s,60個循環,于65 ℃ 45 s處收集熒光信號,熒光通道為FAM。

方法二:反應體系配制完成后加入0.2 mL的HF管的大隔室,再加入50 μL的穩定液,最后向小隔室加入1～2 μL的100×SYBR Green I顯色液進行擴增。通過實時熒光PCR儀設定Holding Stage為65 ℃ 30 s,1個循環;Cycling Stage為65 ℃ 15 s,65 ℃ 45 s,60個循環,當反應程序結束后,將HF反應管倒置甩動2次,在正置甩動2次,使工作液與顯色液充分混合,冷卻至室溫后,肉眼觀察,顏色變綠表明發生了擴增,橙色表明未發生擴增。

1.2.4 LAMP特異性實驗 采用優化好的LAMP方法對牛油、羊油、豬油、雞油及六種植物油樣品DNA進行LAMP擴增,以驗證特異性引物對牛、羊、豬和雞源性成分檢測的特異性,設置程序,65 ℃ 1 h,擴增產物采用實時熒光法，加入SYBR Green I熒光染料進行觀察。

1.2.5 LAMP靈敏性實驗 分別提取牛油、羊油、豬油和大豆油中的總DNA,測定DNA濃度,將牛油、羊油、豬油用大豆油梯度稀釋至含0.10、0.01、0.001 ng/μL三個濃度梯度的樣品作為DNA模板。采用優化好的LAMP方法對牛油、羊油、豬油三種混合樣品的三個稀釋梯度進行LAMP擴增,設置1.2.3中方法二的程序,65 ℃ 1 h,擴增產物加入SYBR Green I熒光染料進行觀察。當反應程序結束后,將HF反應管倒置甩動2次,在正置甩動2次,使工作液與顯色液充分混合,冷卻至室溫后,肉眼觀察,顏色變綠表明發生了擴增,橙色表明未發生擴增。

1.2.6 LAMP穩定性實驗 采用優化好的LAMP方法,將牛、羊、豬和雞四種不同DNA濃度的油脂,每個樣品設置4管平行,同時設置1管陰性對照和大豆油、花生油以及玉米油三種植物油對照,進行LAMP擴增,設置1.2.3中方法二的程序,65 ℃ 1 h,擴增產物是加入SYBR Green I熒光染料進行觀察。當反應程序結束后,將HF反應管倒置甩動2次,在正置甩動2次,使工作液與顯色液充分混合,冷卻至室溫后,肉眼觀察,顏色變綠表明發生了擴增,橙色表明未發生擴增。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取結果

本研究采用SDS堿裂解法提取植物油和動物油脂中的總DNA,獲得牛、羊、豬和雞四個物種DNA模板的純度260/280比值在1.8～2.0之間,濃度在16.0～30.0 ng/μL。大豆油、花生油、玉米油、橄欖油和2種植物調和油的DNA模板純度260/280比值在1.8～2.0之間,濃度在2.0～10.0 ng/μL之間。樣品DNA的濃度及純度適合后續的擴增反應,且符合后續擴增曲線的結果。

2.2 LAMP反應體系優化結果

本研究通過預實驗,選定羊DNA作為標準體系,測定DNA濃度,并梯度稀釋至0.10、0.01、0.001 ng/μL三個濃度梯度作為優化標準,對甜菜堿、Bst DNA聚合酶等參數進行了優化。經過一系列的優化實驗后,最終確定LAMP(25 μL)反應體系為:1.6 μmol/L內引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgS04,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U BstDNA聚合酶,在65 ℃條件下擴增1 h。在該反應體系下,羊DNA的擴增結果見圖1。

圖1 實時熒光LAMP優化結果Fig.1 Real-time fluorescence LAMP reaction under the optimized condition注:1:陽性對照(豬質粒);2:羊DNA模板濃度0.1 ng/μL;3:羊DNA模板濃度0.01 ng/μL;4:羊DNA模板濃度0.001 ng/μL;5:陰性對照(雙蒸水)。

2.3 LAMP特異性檢測實驗

本研究選取生活中常用的大豆油、花生油等六種植物油以及常見的牛、羊、豬和雞四種動物油脂作為研究對象。實時熒光擴增曲線和LAMP染色法結果見圖2。LAMP擴增產物的實時熒光曲線圖表明,該法僅對牛油、羊油、豬油、雞油這四種樣品油脂發生了特異性擴增,其他油脂和陰性對照均未起峰。擴增產物的LAMP肉眼觀察法結果與實時熒光LAMP法相一致,均是牛油、羊油、豬油和雞油為陽性,其余油脂以及陰性對照為正常陰性。這表明上述LAMP引物在DNA模板純度合適的情況下,對油脂中動物源性成分檢測具有很好的特異性。

圖2 LAMP特異性檢測結果Fig.2 Specificity detection by LAMP注:1:陰性對照(雙蒸水);2:陽性對照(豬質粒);3:牛油DNA;4:豬油DNA;5:雞油DNA;6:羊油DNA;a:大豆油;b:花生油;c:玉米油;d:橄欖油;e:植物調和油1;f:植物調和油2。

2.4 LAMP靈敏度檢測結果

采用熒光染色法對結果進行判定,其擴增結果見圖3。結果顯示,牛油、羊油及豬油三種動物油脂DNA樣品與大豆油DNA混合后,被稀釋成0.01 ng/μL時能檢測出動物源性,但當稀釋成0.001 ng/μL后HF管內呈現橙色,即未發生擴增。由此表明,LAMP方法可以檢測出大豆油中含有0.01 ng/μL的動物源性成分,即植物油中摻入動物油脂的最低檢出限度是0.01 ng/μL。當擴增產物的濃度低時,肉眼觀察結果易產生誤差[22]。根據專利[21]報道,采用LAMP技術鑒別地溝油時,當LAMP檢測結果為陽性時,該待檢樣品為地溝油。當LAMP檢測結果為陰性時,且待檢測樣品DNA的濃度偏差小于同等條件下市售標準油脂樣品處理后的濃度的1%時,則應判斷樣品為地溝油。

圖3 LAMP靈敏度檢測結果Fig.3 Sensitivity detectionby LAMP注:N:陰性對照(雙蒸水);A-1:混合樣品含豬油DNA濃度0.001 ng/μL;A-2:混合樣品含豬油DNA濃度0.01 ng/μL;A-3:混合樣品含豬油DNA濃度0.1 ng/μL;B-1:混合樣品含牛油DNA濃度0.001 ng/μL;B-2:混合樣品含牛油DNA濃度0.01 ng/μL;B-3:混合樣品含牛油DNA濃度0.1 ng/μL;C-1:混合樣品含羊油DNA濃度0.001 ng/μL;C-2:混合樣品含羊油DNA濃度0.01 ng/μL;C-3:混合樣品含羊油DNA濃度0.1 ng/μL。

2.5 LAMP穩定性檢測結果

由于地溝油成分的復雜性,單一指標難以涵蓋所有種類的地溝油,且檢測指標易受精煉程度和人為勾兌的影響。因此,在研究地溝油檢測指標特點的同時,還需對其穩定性進行評價。其擴增結果見圖4,結果表明,牛、羊、豬和雞四種不同DNA濃度的油脂均發生擴增,陰性對照和大豆油、花生油以及玉米油均未發生擴增,說明LAMP擴增技術具有很好的穩定性,適合做快速檢測,同時他對儀器設備的要求不高,表明在現場檢測中有很高的適應性。

圖4 LAMP穩定性檢測結果Fig.4 Stability detection by LAMP注:N:陰性對照(雙蒸水);1:大豆油;2:花生油;3:玉米油;A:雞油DNA;B:豬油DNA;C:牛油DNA;D:羊油DNA。

3 討論與結論

地溝油的來源多樣、加工工藝不同,有的地溝油經過高溫、粉碎、攪拌等生產處理,細胞核基因組往往被破壞,石亞新[23]以雞油和豬油為代表的動物油脂進行脫膠、脫色、脫臭處理,模擬油脂精煉工藝,研究其 DNA 信息衰減變化。實驗結果表明,雞油精煉處理后 DNA 含量下降了9.5%,豬油下降了11%,因此證實了油脂精煉工藝會對動物基因信息造成部分損失。楊冬燕等[24]以動物源性HOXC6基因為特異性檢測指標,采用實時熒光PCR法檢測食用油中摻假地溝油時發現,隨著地溝油含量的降低其檢測準確率也隨之降低。因此,在檢測地溝油時,檢測靶標DNA是分子生物學技術能否成功檢驗地溝油的關鍵因素。線粒體DNA具有穩定性好、分子量小、拷貝數多等特點,在地溝油的反復精煉過程中,具有更高的靈敏度和穩定性,可作為動物性外源成分鑒定和物種分類等技術的理想靶基因[25]。

LAMP技術的發展十分迅速,已成功的應用于致病菌[26-28]、轉基因成分[29-31]的檢測等方面,而且其靈敏度高,檢測極限能達到10拷貝[32-33]。本研究建立的LAMP法檢測植物油中摻假地溝油,在1.6 μmol/L內引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgS04,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U Bst DNA聚合酶,擴增溫度為65 ℃,擴增時間為1 h的優化條件下,能檢出模擬地溝油樣品中0.01 ng/μL的動物源性DNA成分。但因地溝油樣品來源的限制,下一步還需擴大樣品量,以提高實驗檢測方法的適用性。

本研究以植物油中不應該存在動物源性成分為鑒定依據,以動物線粒體DNA為檢測靶標,針對靶基因的六個區域,設計了兩對特異性引物,建立了利用LAMP法檢測食用植物油和地溝油中動物源性成分的新方法。該方法不需要特殊試劑與設備,檢測成本低,且重復性好、穩定性高,能夠特異性擴增出牛、羊、豬和雞等脊椎動物的動物源性基因。為油脂鑒偽和地溝油的鑒別提供一種穩定、高效、適應性強的現場快速檢測技術。

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